Benemérita Universidad

Autónoma de Puebla
Microbiología
Profesora: Laura Martínez Pérez

Sección: miércoles 10-12 y jueves

11-12

Cosme Benito Cortes

Aarón de Jesús García Camarillo
 Práctica No. 5

Aislamiento de microorganismos por estría cruzada

Introducción
Los estudios que implican los cultivos microbianos a menudo requieren la identificación de
los organismos presentes en un cultivo. Cuando una pequeña porción de este cultivo se inserta
en un medio nutriente que contiene agar, es posible mezclar una mezcla de bacterias
individuales en unidades que forman colonias.
Materiales
Estriar una placa de agar requiere placas de agar nutrientes, un asa para la inoculación, un
cultivo de bacterias, una disolución desinfectante como lysol al 10%y un mechero de bunsen.
También tendrás que vestir ropa de seguridad como una bata de laboratorio, y lentes de
seguridad contra productos químicos. El inoculo para rayar se toma a partir del cultivo stock
bacteriano utilizando el asa y estriando a través de las placas de agar nutriente.
Métodos-técnicas
• Estriado básico
Calienta el asa de inoculación *hasta que quede de color rojo intenso para eliminar cualquier
microorganismo. Deja que el asa se enfrié durante 20 o 30 segundos, pero no lo soples para
no reintroducir microorganismos. Recoge una muestra de cultivo bacteriano a partir de un
caldo o de una placa Petri, no necesitas una presencia bacteriana visible. Levanta la placa de
Petri, que vas a sembrar en un ángulo de 45 grados, coloca el asa en la parte de atrás del plato,
toca con el asa en el medio y pásalo a través de la superficie de la placa con un movimiento
en forma de ``S`` de atrás hacia adelante.
• Estriar para aislar
Implica una sola inoculación de una sección de la placa Petri y a continuación, disminuir la
colonia arrastrando microorganismos de la sección inicial de dos otras secciones adicionales,
achicando eficazmente la población de microorganismos generalmente utilizado para separar
un cultivo mixto de las bacterias, los bactemotogos también utilizan este método para aislar
una línea de bacterias que nacen de un solo progenitor
• Estriado en ``T``
Para Llevar a cabo con precisión un estriado en T, dibuja una T en la parte posterior de la
placa Petri. Voltea la tapa de la placa hacia abajo, con un marcador permanente, divídela por
la mitad. Dibuja una línea divisora en una de las mitades hasta formar una T. jira la placa de
manera que la sección más grande quede a tu derecha. Inocula el asa de acuerdo con el
procedimiento anterior. Levanta la tapa e inocula le medio con el barrido en forma de S pero
no crucen la línea media.
• Estriado por cuadrantes
Este es un método de estriado para el aislamiento, pero utiliza cuatro secciones en lugar de
3. Divide la parte inferior de la placa Petri en 4 partes iguales con un marcador permanente.
Utiliza los procedimientos básicos de estriado para inocular el primer cuadrante. Trabajo en
el sentido de las agujas del reloj, llevando los microorganismos de un cuadrante a otro como
lo hiciste en el método de estratificado en T y calentado el asa antes de inocular el siguiente
cuadrante. Calienta el asa y barre en forma de S desde el uno hasta el cuadrante adyacente.
BD Mannitol Salt Agar
USO PREVISTO
BD Mannitol Salt Agar se utiliza para el aislamiento selectivo de estafilococos y para la
detección de Staphylococcus aureus a partir de muestras clínicas.
PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO
Método microbiológico.
El agar sal manitol en una fórmula diseñada por Chapman para la diferenciación de
estafilococos positivos a la coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus) de los
estafilococos negativos a la coagulasa1. Este agar se utiliza para el aislamiento de
estafilococos a partir de muestras clínicas2, de cosméticos3 y de pruebas de límite
microbiano4, 5. El agar sal manitol contiene peptonas y extractos de carne bovina, que
suministran los nutrientes esenciales. Una concentración de cloruro sódico de 7,5% tiene
como resultado una inhibición parcial o completa de los organismos bacterianos diferentes
de los estafilococos. La fermentación de manitol, indicada por el cambio del indicador de
rojo fenol, facilita la diferenciación de la especie de estafilococos. Los estafilococos positivos
a la coagulasa (por ejemplo, Staphylococcus aureus) producen colonias de color amarillo y
un medio circundante de color amarillo, mientras que los estafilococos negativos a la
coagulasa producen colonias de color rojo y no producen cambio de color en el indicador de
rojo fenol1.
REACTIVOS
BD Mannitol Salt Agar
Fórmula* por litro de agua purificada
Extracto de carne bovina 1,0 g
Digerido pancreático de caseína 5,0
Digerido péptico de tejido animal 5,0
Cloruro sódico 75,0
D-manitol 10,0
Rojo fenol 0,025
Agar 15,0 pH 7,4 ± 0,2
* Ajustada y/o suplementada para cumplir los criterios de rendimiento.
Organismos Resultados del crecimiento
 Staphylococcus aureus Colonias amarillas de tamaño medio, amarillo medio.
 Staphylococcus epidermidis Colonias blancas de tamaño pequeño a medio, rojo
medio. Estafilococos diferentes de S. aureus y S. epidermidis Colonias de tamaño
pequeño a grande, con zonas de color rojo o amarillo, según la especie.
 Micrococos Grandes, de color blanco a anaranjado Enterococcus, Streptococcus Sin
crecimiento a crecimiento muy débil.
 Bacterias gram negativas Sin crecimiento a crecimiento débil.
 Las colonias que muestran una apariencia de estafilococos deben ser sometidas a otras
pruebas de diferenciación para confirmar su identidad.
Agar Mac Conkey
Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de gérmenes Gram positivos. La
lactosa y el indicador de pH rojo neutro, permiten la diferenciación de las bacterias lactosa
positiva (colonias rosas intenso con halo de precipitación), de las no fermentadoras (colonias
transparentes o ámbar). Sembrar el medio de cultivo con la muestra problema por estría
cruzada. Incubar 24 h a 35ºC.
Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de organismos coliformes, Salmonella
y Shigella a partir de diversas muestras.
Preparación:
Rehidratar 50 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 10 a 15 minutos. Calentar
agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para disolverlo por
completo. Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante 15 minutos. Enfriar
aproximadamente a 45°C. Vaciar en cajas de Petri estériles. Conservar en refrigeración de 2
a 8ºC.
Formula En Gramos Por Litro De Agua Destilada:
 Agar 13.5
 Mezcla de sales biliares 1.5
 Cloruro de sodio 5.0
 Peptona especial 3.0
 Cristal violeta 0.001
 Peptona de gelatina 17.0
 Lactosa 10.0
 Rojo neutro 0.03 (pH 7.1 ± 0.2)
CONTROL DE ACTIVIDAD MICROORGANISMO:
 Escherichia coli–Colonias grandes, rosa intenso con halo de precipitación.
 Salmonella typhimurium–Colonias medianas, incoloras transparentes.
  Proteus mirabilis–Colonias grandes, incoloras opacas, inhibición total o parcial del
swarming.
 Enterococcus faecalis–Inhibición parcial.
 Staphylococcus aureus–Crecimiento inhibido.
BD Brain Heart Infusion (BHI) Agar
USO PREVISTO
BD Brain Heart Infusion (BHI) Agar es un medio de uso general adecuado para el cultivo de una
amplia variedad de tipos de organismos, incluidos las bacterias, levaduras y hongos filamentosos, a
partir de muestras clínicas.

PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO

Método microbiológico.
La infusión de cerebro y corazón ha resultado ser efectiva en el cultivo de una amplia variedad de
microorganismos, incluidos muchos tipos de patógenos. Se ha utilizado como medio base para las
nuevas fórmulas de medios de cultivo cuando se suplementa con sangre o agentes selectivos. Brain
Heart Infusion (BHI) Agar sin suplemento se recomienda actualmente como medio universal para
bacteriología aerobia y para la recuperación primaria de hongos y Actinomycetales a partir de
muestras clínicas y no clínicas1-5. BD Brain Heart Infusion (BHI) Agar obtiene los nutrientes de la
infusión de cerebro y corazón, la peptona y la glucosa. Las peptonas y la infusión son fuentes de
nitrógeno orgánico, carbono, azufre, vitaminas y sustancias de traza. La glucosa es la fuente de
carbohidratos que los microorganismos utilizan mediante fermentación. Se utiliza fosfato disódico
como tampón en el medio.

REACTIVOS
BD Brain Heart Infusion (BHI) Agar

Fórmula* por litro de agua purificada

 Infusión de cerebro y corazón de (sólidos) 8,0 g

 Digerido péptico de tejido animal 5,0
 Digerido pancreático de caseína 16,0
 Cloruro sódico 5,0
 Glucosa 2,0
 Fosfato disódico de hidrógeno 2,5
 Agar 13,5

pH 7,4 ± 0,2

*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.

 Metodología

Se tomo un poco de una Se coloco en la placa y se Despues se comenzo a

Se esterilizó el asa
bacteria de un cultivo ya extendio en un tercio de la estriar perpendicularmente
bacteriológica.
hecho. caja petri. al extendido masivo.

El estriado se hizo hasta
abarcar el mayor espacio
posible.
En el ultimo estriado se
hizo un estriado
Se dejo incubar durante 24
denminado "cola de ratón",
horas a 37°C.
con el cual se terminaba el
proceso.

Resultados
Enterobacterias Staphylococcus aureus

Ilustración 2 Cultivo de Ilustración 3 Cultivo de Ilustración 4 Cultivo de

Ilustración 1 Cultivo de
enterobacterias en Agar Infusión Staphylococcus aureus en Agar Staphylococcus aureus en Agar
enterobacterias en Agar
Cerebro-Corazón. Infusión Cerebro-Corazón. Sal y Manitol.
MacConkey.

Discusión de resultados
Se logró un crecimiento óptimo de los microorganismos. Debido a la falta de experiencia y que era
la primera vez que hacíamos esta técnica, algunos de nuestros cultivos presentaban un
acumulamiento de excesivo. Si se lograron aislar los microrganismos, en algunos casos de manera
óptima, con la excepción de entero bacteria en agar en infusión cerebro corazón, ya que a pesar de
si presentar un aislamiento, estos se encontraban muy juntos y de un tamaño muy grande.

Cuestionario
1.- ¿Por qué se incuban las cajas con las tapas hacia abajo?
- Si la placa no es invertida durante la incubación, la bacteria no podrá colonizar el agar
apropiadamente, lo que evitará que crezca y forme colonias adecuadamente, o estimulará el
crecimiento de otros microorganismos. También si se condensa agua en la tapa de la caja Petri, estas
gotas de agua pueden llegar a caes en el agar y así dañar el cultivo.
2.- ¿Qué ventajas e inconvenientes ofrece el método de la estría cruzada?

3.- ¿Con qué propósito se emplean las otras técnicas de siembra diferentes a la
estría cruzada?
- Con el propósito de obtener varias maneras de disposición de las colonias, ya sea en superficie o
incorporación.

4.- ¿Cuál es la diferencia entre un medio sólido, semisólido y líquido?

- Líquidos: soluciones acuosas de uno más componentes.

- Sólidos: Son medios de cultivo que contienen también un agente solidificante o gelificante por
debajo de los 45⁰C como el ágar-ágar, en concentraciones oscilan entre 1-2%.

- Semi-sólido: Son medio vertidos en forma inclinada, que contiene 0.15% de ágar-ágar.

5.- ¿Qué tipo de medio es el agar es el medio nutritivo y para que se utiliza?
- Medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento y recuento de
microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. Su uso está descripto en
procedimientos para el análisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.
Medio de cultivo nutritivo no selectivo, en el cual la pluripeptona y el extracto de carne constituyen
la fuente de carbono, nitrógeno y aportan nutrientes para el desarrollo bacteriano. El agregado de
cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el agar es el agente solidificante.

Conclusión
Aprendimos a utilizar el método de estría cruzada y logrando un aislamiento de los microorganismos
en cuestión de manera efectiva.

Bibliografía
 https://www.google.com/amp/s/www.geniolandia.com/13150463/por-que-las-placas-de-
agar-deben-mantenerse-boca-abajo
 https://es.slideshare.net/JhanCarranzaCabrera/informes-de-microbiologia-primera-
unidad-1-7?fbclid=IwAR2wSA_xZB
aoggH3Fvg0udfmRcyVHhHECta8kRhCzzo9PlLeb_NzQkKjJI
 MacFaddin. 1985. Media for isolation-cultivation-identification- maintenance of medical
bacteria, vol. 1. Williams & Wilkins, Balti- more, Md.
 Downes and Ito (ed.). 2001. Compendium of methods for the mi- crobiological
examination of foods, 4th ed. American Public Health Association, Washington, D.C.
 https://es.slideshare.net/aguero-luna/medios-de-cultivos-cindy-
tania?fbclid=IwAR3IU9hSc35YfepxYYiDXIF0mOWD2u3MwjcE68izmJxxtKzAqKxAfn1JjAA