UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y TEXTIL

Departamento Académico de Ingeniería Química

Laboratorio de Bioquímica y Microbiología

PI-721/A

Identificación cuantitativa de lípidos

Realizado por:

Profesora responsable de la práctica:

PhD. Jessica Nieto Juárez

Ing. Janet Rojas Orosco

Periodo académico: 2021-1

Fecha: 24 de mayo de 2021

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Identificación cuantitativa de lípidos

Introducción

Los lípidos son mezclas de composición química compleja y muy diversos uno del otro, pero

poseen características en común, una de ellas es que son solubles en disolventes orgánicos e

insolubles en disolventes polares, como el agua. La determinación cuantitativa de cualquier tipo

de lípido aprovecha dicha característica.

La resonancia magnética nuclear (RMN, o NMR en inglés) puede emplearse para determinar

la cantidad de lípidos en alimentos de una manera no destructiva. Los principios de NMR pueden

ser muy complejos; pero su uso es muy sencillo, es reproducible y rápido, principalmente debido

al alto grado de automatización y control por computadora. La RMN cuantitativa (qNMR, por

sus siglas en inglés) hace uso de la RMN para determinar la concentración de una o más especies

química es solución. Para lograrlo, se aprovecha de la relación lineal entre las intensidades

integradas de las resonancias de los componentes por separado en el espectro y sus contenidos en

las sustancias estudiadas; por tanto, podríamos cuantificar muestras complejas en un ensayo sin

realizar algún tipo de separación previa.

El método qNMR solo requiere que una muestra se disuelva completamente en un solvente, y

que contenga núcleos activos al NMR. No obstante, el lugar donde se analiza la muestra debe

cumplir con ciertos requisitos como no presentar vacío, temperaturas irregulares o condiciones

electrostáticas irregulares. Una vez satisfechas las condiciones externas, la qNMR solo es

influida por factores como que el volumen del tubo de NMR para el análisis de la muestra debe

ser de un volumen idéntico al del estándar de referencia, la temperatura y la susceptibilidad

magnética deben estar en el mismo rango, el campo magnético debe ser homogéneo para ambas
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mediciones, tanto la muestra como el estándar de referencia deben estar completamente disueltos

y la señal y el ruido deben mantener una proporción apropiada. Los dos primeros puntos pueden

ser resueltos empleando el método del estándar interno, pero este requiere algunas condiciones

adicionales, siendo las más importantes que no exista una reacción química entre el solvente o el

elemento de prueba y el estándar de referencia, y que al menos una señal del elemento de prueba

y el estándar interno no deben interferir (mejor si es más de una) entre sí o con el solvente o las

señales del sistema (agua, impurezas, entre otros); es decir, debe proveerse selectividad.

Otros métodos utilizados para la identificación cuantitativa de lípidos involucran la

separación de los lípidos de las muestras para su posterior fraccionamiento por métodos que

permitan diferenciarlos entre los distintos tipos de lípidos o para analizarlos instrumentalmente,

como el espectrómetro de masas. El procedimiento de extracción de los lípidos debe de ser

tratado con mesura, se debe de realizar extracciones rápidas y evitar que los lípidos de las

muestras se expongan al aire, a la luz o al calor, todas estas medidas son tomadas con el fin de

evitar la oxidación de estas moléculas. Los lípidos de las muestras se extraen con disolventes

orgánicos, estos deben de ser retirados en pasos posteriores y dichos procesos deben de ser

realizados en condiciones que no afecten la naturaleza de los lípidos.

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Introducción

En la industria de los lípidos, los métodos volumétricos, presentan ciertas desventajas;

por ejemplo, requieren grandes cantidades de solventes orgánicos y otros químicos tóxicos. El

índice de acidez (IA) es uno de estos métodos, permite determinar la cantidad de ácidos grasos

libres (AGL) y depende de la titulación con solución de hidróxido de potasio metanólico y el

indicador fenolftaleína.

La espectroscopia H RMN (intro)

Es una técnica no destructiva que permite el análisis rápido, simple y simultáneo de

diferentes analitos en una muestra. Las impurezas se pueden detectar mediante la comparación

con un espectro de referencia.

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Parte experimental

Equipo utilizado para la experimentación

Figura 1. Representación de las partes de un espectroscopio de RMN

La muestra ingresa al equipo y el electroimán produce el campo magnético externo alineando los

espines de los núcleos y produciendo una polarización neta. Para lograr campos magnéticos más

intensos, de 7 a 23 teslas (tres veces mayor al campo magnético terrestre) se recurre a

electroimanes superconductores que trabajan a bajas temperaturas (-269 °C), por lo que el

electroimán debe de poseer una doble chaqueta aislante, en la cual la camisa interna tendrá He

líquido y la externa N2 líquido.

Es importante que el equipo trabaje con campos magnéticos muy intensos para lograr mejorar la

sensibilidad y la resolución de señales, por ejemplo, un equipo de 400 MHz (9.4 T) es dos veces

inferior a un equipo de 800 MHz (18.8 T), es decir, las señales son el doble de anchas para el
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equipo de 400 MHz, lo que se puede traducir n el aumento de posibilidades de lecturas con

solapamiento.

La Sonda se encarga de detectar la resonancia de relajación de los núcleos y transforman esas

señales en impulsos eléctricos que envía al receptor de radiofrecuencias para su amplificación y

digitalización.

La consola es un controlador en donde se agrupa la mayor parte de los sistemas electrónicos.

Controla el sistema emisor y receptor de radiofrecuencias, el sistema de bloqueo de frecuencias,

el giro de la muestra y la temperatura.

El ordenador se conecta a la consola para controlar todos los procesos y lanzar instrucciones

necesarias para el análisis, recibe los datos digitalizados y los transforma en espectros

interpretables. Cumple el papel de interfaz entre el operario y el sistema.

El equipo utilizado durante la elaboración de esta experiencia es un Bruker AVANCE 400 MHz

que operaba a 400.17 MHz

Figura 2. Espectrómetro de RMN real

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Tratamiento a la muestra

Para cada medición se utilizó 250 mg de muestra de aceite que fue disuelta en 0.6 ml de una

mezcla con proporciones de 5:1 v/v de Cloroformo deuterado (CDCl3) y

hexadeuterodimetilsulfóxido (DMSO-d6) y una pequeña proporción de tetrametilsilano (TMS)

como una referencia interna. Luego, secamos la muestra sobre un tamiz molecular durante 45

minutos y transferimos la mezcla a un tubo de RMN de 5 mm de diámetro para su análisis. Los

protones del COOH de todos los AGL resuenan como un singlete en la región del campo a

δH 11.6 ppm. Para la cuantificación de los AGL, integramos la señal de COOH y la señal de

α– carbonil CH2 que resuenan en δH 2.2– 2.4 ppm. Para obtener la cantidad de AGL en

mmol/mol TAG, el área pico del α– carbonil CH2 se normalizó a 6000, puesto que un TAG

posee seis protones α– carbonil CH2 . La cantidad molar de AGL se convirtió a IARMN usando la

ecuación modelo determinada experimentalmente:

IA = 0.068 ∙ XAGL + 0.046

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Resultados

Figura 3. Gráficos de IA versus IA determinado por NMR para el aceite de girasol y el aceite de maíz

Figura 4. Gráficos de IA versus IA determinado por NMR para el aceite de oliva

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Figura 5. Gráficos de IA versus IA determinado por NMR para el aceite de canola y el aceite de maní

Figura 6. Gráficos de IA versus IA determinado por NMR para el aceite de linaza, aceite de ajonjolí, manteca de cacao, aceite
de soja y aceite de coco
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El método de RMN es adecuado para reproducir los resultados del método IA clásico, puede ser

aplicado al oleato de oleílo y varias ceras.

El método es una alternativa adecuada al clásico índice de acidez. La espectroscopía H NMR

permite la determinación rápida y sencilla de los AGL en los aceites comestibles. Una ventaja

sobre el método clásico es la posibilidad de determinar simultáneamente la calidad del aceite y

parámetros de autenticidad como la cantidad de hidroperóxidos y aldehídos en el mismo

espectro. Además, los aceites coloreados no representan un problema para el método NMR.
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Referencias bibliográficas

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San Martín, E. (2019). Aplicación de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear al

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Skiera, C., Steliopoulos, P., Kuballa, T., Diehl, B. y Holzgrabe, U. (2014). Determination of free

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