UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERÍA

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y TEXTIL

Departamento Académico de Ingeniería Química

Laboratorio de Bioquímica y Microbiología

PI-721/A

Identificación de enzimas en alimentos

Realizado por:

Profesora responsable de la práctica:

Ing. Janet Rojas Orosco

Periodo académico: 2021-1

Fecha: 19 de mayo de 2021

Tabla de Contenido

Identificación de enzimas en alimentos .......................................................................................... 1

Objetivos ..................................................................................................................................... 1

Objetivo general ...................................................................................................................... 1

Objetivos específicos ............................................................................................................... 1

Fundamento teórico ..................................................................................................................... 1

Parte experimental ....................................................................................................................... 5

Materiales ................................................................................................................................ 5

Reactivos ................................................................................................................................. 7

Diagrama de Flu|jo .................................................................................................................. 8

Discusión de resultados ............................................................................................................. 11

Reconocimiento de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales ................................ 11

Efecto de la temperatura sobre la enzima catalasa ................................................................ 12

Actividad de la enzima α-amilasa y efecto del pH ................................................................ 13

Conclusiones ............................................................................................................................. 14

Cuestionario .............................................................................................................................. 15

Referencias bibliográficas ......................................................................................................... 19

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Identificación de enzimas en alimentos

Objetivos

Objetivo general

Identificar la actividad de enzimas presentes en tejidos animales y vegetales.

Objetivos específicos

• Identificar la actividad de la enzima catalasa en muestras de tejidos animales y vegetales

mediante la adición de peróxido de hidrógeno.

• Cuantificar el tiempo de reacción de muestras de papa, piña, zanahoria, melocotón,

hígado, apio, cebolla y plátano con peróxido de hidrógeno y el desprendimiento de

oxígeno.

• Determinar la dependencia de la velocidad de reacción de la enzima catalasa con

peróxido de hidrógeno a distintos valores de temperatura.

• Determinar el efecto del pH sobre la actividad de la enzima α-amilasa frente al almidón

mediante la identificación de glucosa con la prueba de Fehling.

Fundamento teórico

Enzimas

Las enzimas son proteínas (con excepción de un pequeño grupo de moléculas de RNA)

que fungen el papel de catalizadores de reacciones que ocurren en sistemas biológicos, su poder

catalítico puede superar al de los catalizadores inorgánicos o sintéticos. Poseen un alto grado de

especificidad con respecto a sus sustratos, aceleran las reacciones químicas específicas y

funcionan en soluciones acuosas bajo condiciones moderadas de temperatura y pH. En un

 2

organismo catalizan cientos de reacciones en las que degradan nutrientes, transforman la energía

química y fabrican macromoléculas biológicas a partir de precursores más sencillos. Como la

mayoría de enzimas son proteínas, su capacidad catalítica dependerá de la integridad de su

conformación proteica nativa, es decir, si una enzima se desnaturaliza o se disocia en sus

aminoácidos constituyentes la actividad catalítica desaparece.

Cinética enzimática

Efecto de la concentración de los sustratos: la concentración de los sustratos presentes es

uno de los factores que afecta la velocidad de reacción catalizada por las enzimas. Este

parámetro es un poco complicado de estudiar, debido a que la concentración del sustrato cambia

conforme avance la reacción para superar este inconveniente nos podemos ayudar realizando una

consideración que ayuda a simplificar los estudios cinéticos. Esta consiste en medir la velocidad

inicial (V0), en una reacción catalítica típica, las concentraciones de la enzima están en órdenes

nanomolares, mientras que la del sustrato [S] puede ser de seis veces órdenes de magnitud,

entonces, si tomamos datos en inicios de la reacción (60 primeros segundos) la concentración del

sustrato puede considerarse constante. Aprovechando esto podemos realizar más mediciones de

V0 cambiando la concentración del sustrato [S] y manteniendo la concentración de la enzima

constante, este comportamiento general se puede observar en la figura 1. Como se observa, la V0

alcanza un valor máximo y esto se puede explicar debido a que todas las moléculas de enzima

están ocupadas por moléculas de sustrato y por más que se incremente la [S] la velocidad no

aumentará.
 3

Figura 1. Perfiles de velocidad de una reacción enzimática frente a la concentración del sustrato

Efecto del pH: las enzimas tienen un pH óptimo o un intervalo en donde su capacidad

catalizadora es máxima, si estos valores se incrementan o disminuyen su actividad disminuye.

Esto es debido a que algunas cadenas laterales de aminoácidos pueden actuar como ácidos o

bases débiles que desarrollan funciones esenciales en el sitio activo de la enzima, por lo que

dependen de un mantenimiento del grado de ionización.

Figura 2. Perfiles de velocidad de una reacción enzimática frente al pH del sustrato

 4

Efecto de la temperatura: Por lo general la temperatura incrementa la cinética de

cualquier reacción, lo mismo ocurre con las reacciones enzimáticas, el incremento de la

temperatura aumenta la velocidad de reacción, pues se incrementa la movilidad de las moléculas

reaccionantes. Pero se debe de tener en cuenta que las enzimas son proteínas, por lo que una

variación desmesurada en la temperatura puede llegar a degradarlas y afectar su centro activo,

por lo que la actividad enzimática disminuiría, en la figura 3 se muestra el comportamiento

general de la velocidad de reacción con respecto a la temperatura.

Figura 3. Perfiles de velocidad de una reacción enzimática frente a la temperatura

Efecto de la concentración de la enzima: la velocidad de una reacción enzimática está

relacionada directamente con la concentración de la enzima y esta velocidad será diferente para

cada enzima, este comportamiento se observa en la figura 4

 5

Figura 4. Perfiles de velocidad de una reacción enzimática frente a la concentración de la enzima

Parte experimental

Materiales

• 10 tubos de ensayo • 01 vaso de precipitado 600 ml

• 02 vasos de precipitado 100 ml

• 01 gradilla para tubos

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• 02 pipetas graduadas de 10 ml • 01 bagueta de vidrio

• 01 pipetas graduadas de 5 ml

• 01 pipeta graduada de 1 ml

• 01 gotero

• 01 pro-pipeta

• Cronómetro

• 02 fiolas de 100 ml

• Termómetro
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Reactivos

• Peróxido de Hidrogeno 30% (v/v)

Es nocivo en caso de ingestión y provoca lesiones oculares graves. Además, es nocivo

para los organismos acuáticos.

• Solución de almidón 0.5 %

Puede provocar una reacción alérgica en la piel. Podría perjudicar la fertilidad o dañar al

feto.

• HCl 0.1 N

Puede ser corrosivo para los metales. Causa irritación a la piel y a los ojos. La ingestión

daña el sistema circulatorio y la destrucción del esófago y el tracto digestivo.

• NaOH 0.1 N

Corrosivo para los metales. Causa irritación a la piel y a los ojos. La ingestión causa daño

permanente al tracto digestivo. El contacto prolongado o repetitivo con la piel puede

causar dermatitis.

• Reactivo de Fehling A y B

Consiste en una mezcla de dos reactivos, el reactivo Fehling A (solución acuosa de

sulfato de cobre) y el reactivo Fehling B (mezcla de tartrato de sodio y potasio en NaOH

al 40%). Puede causar lesiones oculares graves o irritación ocular. Además, es peligroso

para el medio ambiente acuático.

• Reactivo Lugol

Consiste en una mezcla acuosa de yodo y yoduro de potasio. En caso de inhalación,

puede provocar síntomas de alergia, asma o dificultades respiratorias. También puede

provocar una reacción alérgica en la piel.

 8

Diagrama de Flu|jo

Reconocimiento de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales.

Hígado de res* H2O2 30%

3 ml

Formación de burbujas
t=0
t = trxn

*: Repetir con carne de res molida, tomate, zanahoria y papa.

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Efecto de la temperatura sobre la enzima catalasa.

Extracto de papa Extracto de hígado

5 ml 5 ml

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10)

(1) (6) (3) (8)

(2) (7)

Temperatura
Baño de hielo ambiente
30 minutos Baño María
30-40 °C
10 minutos

(4) (9)
(5) (10)

Baño María
40-50 °C Baño María
10 minutos 50-60 °C
10 minutos

H2O2 30%
3 ml

Formación de burbujas
t=0 t = trxn

Realizar para cada tubo:

 10

Actividad de la enzima α-amilasa y efecto del pH.

Almidón 0.5%
3ml

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7)

(8)

HCl 0.1 N NaOH 0.1 N

0.2 ml 0.2 ml

(5) (6) (7) (8)

Saliva 2%
1 ml

(3) (4) (5) (6) (7) (8)

Baño María
37 °C
30 minutos

(2) (4) (6) (8)

(1) (3) (5) (7)
Prueba de Prueba de
Fehling Lugol
 11

Discusión de resultados

Reconocimiento de la enzima catalasa en tejidos animales y vegetales

• Los resultados indican que los tejidos animales (en este caso, hígado) presentan mayor

desprendimiento de oxígeno, lo cual se ve reflejado en la altura alcanzada por las

burbujas (11.7 cm) en un corto tiempo (4 s); a diferencia de las demás muestras, en las

que las burbujas alcanzaron menores alturas y se requirió de mayor tiempo.

• El hígado presenta mayor actividad enzimática, esto se ve reflejado en su gran velocidad

de burbujeo de 29.25 mm/s; mientras que la cebolla es la que presenta menor actividad

enzimática indicado por su baja velocidad de burbujeo 0.631 mm/s.

• La actividad enzimática de la catalasa presenta diferencias significativas en tejidos

animales y tejidos vegetales, siendo mayor en los tejidos animales.

• En los seres humanos, la catalasa protege la hemoglobina de los efectos tóxicos del

peróxido de hidrógeno, al convertirla en agua y oxígeno. El oxígeno desprendido se

manifiesta en forma de burbujas y nos permite medir la actividad enzimática en distintos

organismos.
 12

Efecto de la temperatura sobre la enzima catalasa

Rapidez de reacción (cm/s) 6

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Temperatura (°C)

Figura 5. Perfiles de rapidez de la reacción enzimática de la catalasa frente a la temperatura

El incremento de la temperatura por lo general aumenta la velocidad de reacción

enzimática, pues se incrementa la movilidad de las moléculas reaccionantes. Pero teniendo en

cuenta que las enzimas son proteínas, una variación desmesurada en la temperatura puede llegar

a degradarlas y afectar su centro activo

De acuerdo a la figura 5, que corresponde a la reacción enzimática de la catalasa con una

mezcla de material orgánico (extracto de papa, hígado y agua), la temperatura en la que se

presenta una mayor actividad corresponde a los 34 °C , mientras que la mínima se alcanza a los

58 °C. Esta disminución de la actividad de la enzima a altas temperaturas se debe a que la

proteína pierde su estructura tridimensional debido a la rotura de los enlaces, es decir la proteína

(enzima) se desnaturaliza, afectando su centro activo lo que ocasiona que la actividad enzimática

disminuya.
 13

Actividad de la enzima α-amilasa y efecto del pH

Ya que la función de la α-amilasa consiste en facilitar la hidrólisis del almidón y la

consecuente ruptura de sus enlaces para dar cadenas de glucosa de diferente tamaño, que

eventualmente formarán unidades de glucosa, especies químicas correspondientes a

carbohidratos reductores, la actividad de la enzima α-amilasa queda demostrada en aquellos

tubos que muestren el precipitado rojizo de Cu2O al aplicar la prueba de Fehling, pues dicho

precipitado evidencia la reducción de los iones Cu2+ a Cu+. Los tubos cuyo contenido muestra

este comportamiento son los que contienen la solución de almidón y α-amilasa (tubo 2, pH = 7) y

la solución de almidón, α-amilasa y NaOH (tubo 4, pH = 11), por lo que es en estas muestras

donde la α-amilasa tiene actividad.

El tubo que contiene una solución de almidón, α-amilasa y HCl (tubo 3, pH = 2) no

muestra el precipitado descrito, por lo que en dicha muestra no se evidencia la actividad de la α-

amilasa (el almidón no se ha disociado en cadenas de glucosa más pequeñas). Debe tenerse en

cuenta que el precipitado de Cu2O se forma en medio básico, por lo que se debe haber agregado

el reactivo de Fehling en una cantidad suficiente para garantizar la alcalinidad del medio. El

hecho de que la α-amilasa no muestre actividad habiendo dotado al medio de un pH alcalino,

como el de las otras muestras, indica que esta enzima se ha desnaturalizado de manera

irreversible al estar expuesta a un medio muy ácido (en este caso, pH = 2), permaneciendo en

este estado al volver a incrementarse el valor de pH. Este comportamiento es análogo a la

completa inactivación de la α-amilasa salivar en el líquido estomacal al llegar a un pH de 4

(Freitas et al., 2018) o 3 (Fried et al., 1987).

La menor formación de precipitado en el tubo 4 (pH = 11), comparado con el tubo 2 (pH

= 7) indica una menor reducción de los iones Cu2+ a Cu+, es decir, una menor presencia de
 14

glucosa a causa de una menor hidrólisis del almidón por parte de la α-amilasa de la saliva. Haber

empleado la misma cantidad de almidón en ambas muestras señala que la actividad de la α-

amilasa es menor en el medio alcalino que en el medio neutro. Si bien hay menos estudios sobre

el comportamiento de la α-amilasa en condiciones alcalinas por su menor importancia biológica,

se puede intuir que esto se debe a la mayor ionización de las cadenas laterales de aminoácidos

responsables del mecanismo (ácido aspártico y ácido glutámico) o a una desnaturalización

parcial de la α-amilasa.

En tanto, la mayor formación de precipitado en el tubo 2 (pH = 7) indica una actividad

óptima por parte de la α-amilasa, lo que se corresponde con el pH óptimo encontrado por

diversos autores, como se especificara en la pregunta 3 del cuestionario del presente informe.

Conclusiones

• Los tejidos animales (hígado) presentan un mayor desprendimiento de oxígeno al

reaccionar con H2O2 en corto tiempo (11.7 cm en 4 s), comparados con tejidos vegetales.

• El hígado presenta una mayor actividad enzimática (burbujeo: 29.25 mm/s) que tejidos

vegetales. Se alcanza un mínimo con la muestra de cebolla (0.631 mm/s).

• La mayor actividad de la enzima catalasa se presenta a 34 °C. Esta actividad disminuye a

temperaturas mayores hasta un mínimo a 58 °C por la desnaturalización de la enzima.

• La mayor actividad de la enzima α-amilasa salivar se presenta a un pH de 7. Esta

actividad disminuye a valores mayores o menores de pH por la desnaturalización de la

enzima.
 15

Cuestionario

1. En la superficie de algunas frutas y vegetales cuando se cortan, se forman una

coloración café oscuro denominado pardeamiento enzimático, ¿qué enzima produce

este efecto? Fundamente su respuesta y esquematice las reacciones químicas

involucradas.

El pardeamiento enzimático se produce debido a la oxidación de los compuestos

fenólicos a o-quinonas, compuestos muy reactivos que polimerizan formando melaninas,

cuyo color característico es pardo. Esta reacción se cataliza por enzimas del tipo

oxidasas, polifenol oxidasa y peroxidasa. Los compuestos fenólicos se encuentran en el

citoplasma de la célula, sin contacto con las enzimas encargadas del pardeamiento, que se

encuentran en las membranas mitocondriales y en las membranas tilacoide de los

cloroplastos, en este estado puede existir pardeamiento producto de la pérdida de la

permeabilidad de las paredes celulares, logrando que las enzimas y los sustratos

(compuestos fenólicos) entren en contacto. Cuando se realiza un corte en algunas frutas,

ocasionamos que este contacto ocurra, por lo que el pardeamiento comienza. El

mecanismo de esta reacción enzimática se muestra en la figura 6.

 16

Figura 6. Mecanismo del pardeamiento enzimático

2. ¿Qué métodos o técnicas se podrá recomendar para evitar el pardeamiento de las

frutas y vegetales? Fundamente su respuesta.

El pardeamiento al ser una reacción enzimática, su velocidad está determinada por

la concentración de las enzimas, concentración del sustrato (compuestos fenólicos), el

pH, la temperatura además de la cantidad de agua y oxígeno disponible, entonces, si

controlamos estos factores se puede regular el proceso. Para ello se utilizan métodos

físicos y químicos, entre los físicos tenemos tratamientos térmicos, radiación ionizante,

radiación no ionizante (UV, microondas, ultrasonido), bajas temperaturas y manejo de la

composición de la atmósfera, ya sea mediante el uso de envasado en atmósfera

 17

modificada o recubrimientos comestibles. Los métodos químicos utilizan compuestos que

inhiban la enzima, eliminen sus sustratos (oxígeno y fenoles) o funcionen como un

sustrato preferido.

3. ¿En qué rango de pH trabaja mejor la enzima amilasa?

De acuerdo con lo observado en la experiencia de laboratorio y con el trabajo

publicado por distintos autores como Rudeekulthamrong y Kaulpiboon (2012), Skoluda

et al. (2020), Sundarram y Murthy (2014) y Tatah y Otitoju (2015), el pH óptimo para la

actividad de la α-amilasa salivar es pH = 7, o entre 6 y 7 (Freitas y Le Feunteun, 2019).

Algunos de estos resultados son mostrados en las figuras 7 y 8.

Figura 7. Efecto del pH en la actividad de la α-amilasa salivar humana inmovilizada,

mostrando pH = 7 como valor óptimo. Tomado de Characterization of immobilized post-

carbohydrate meal salivary α-amylase, por V. S. Tatah y O. Otitoju, African Journal of

Biotechnology, 14(31), p. 2475, 2015.

 18

Figura 8. Actividad relativa de la α-amilasa versus pH. Tomado de Kinetic inhibition of

human salivary alpha-amylase by a novel cellobiose-containing tetrasaccharide, por P.

Rudeekulthamrong y J. Kaulpiboon, Journal of the Medical Association of Thailand,

95(1), p. 102, 2012.

 19

Referencias bibliográficas

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Freitas, D., Le Feunteun, S., Panouillé, M. y Souchon, I. (2018). The important role of salivary

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Rudeekulthamrong, P. y Kaulpiboon, J. (2012). Kinetic inhibition of human salivary alpha-

amylase by a novel cellobiose-containing tetrasaccharide, Journal of the Medical

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 20

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Skoluda, N., Dhrami, I. y Nater, U. M. (2020). Factors contributing to stability and instability in

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Tatah, V. S. y Otitoju, O. (2015). Characterization of immobilized post-carbohydrate meal

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