La técnica de PCR y

sus aplicaciones
MÉTODOS EN BIOLOGÍA
Mónica González Sánchez
(Unidad Docente de Genética)
 ¿Qué es la PCR?

• La reacción en cadena de la polimerasa (PCR:

Polymerase Chain Reaction) es una técnica de
amplificación de secuencias de ADN in vitro

The Nobel Prize in Chemistry 1993

Kary B. Mullis
 Estructura del ADN
Macromolécula
(> 10 KDa);
Formada por
subunidades de
NUCLEÓTIDOS
Cadenas con
polaridades
invertidas
(antiparalelas).
Puentes de H
entre las bases
nitrogenadas
Doble hélice
estable

Una molécula de ADN está formada por dos cadenas complementarias

de nucleótidos
Cadenas con polaridades invertidas (antiparalelas).
Puentes de H entre las bases nitrogenadas
Amplificación del ADN mediante PCR
“Genética: Conceptos Esenciales” Benito y Espino. Ed. Panamericana, 2013
 Las copias de DNA obtenidas por PCR crecen
exponencialmente mediante múltiples ciclos de
temperatura

DNA diana inicial

Ciclo térmico

En 32 ciclos, con el 100% de eficacia, se crean

1.07 x 109 copias del DNA diana.
NIST
 Componentes de la PCR

• DNA molde: 100 ng ADN genómico; 10 ng ADN de

bacteria; 1 ng ADN de plásmido
• Cebadores (oligonucleótidos; primers)
• DNA polimerasa termoestable (Taq)
• Los cuatro desoxinucleótidos trifosfatos (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP)
• Tampón de reacción (pH, cationes monovalentes y
divalentes MgCl2 que actúan de cofactores de la Taq)
EXTRACCIÓN DE ADN
Diseño de cebadores (primers)
 Diseño de cebadores (primers)

El diseño de cebadores requiere un conocimiento

previo de la secuencia que queremos amplificar

• LONGITUD: 18-25 nucleótidos, orientados de tal manera

que la síntesis de ADN ocurra entre ellos e hibriden con las
dos hebras de la secuencia que se quiere amplificar

• COMPOSICIÓN: G+C entre 40 y 60%.

• DIMERIZACIÓN: No deben aparear entre si.

Diseño de cebadores (primers)
 ADN polimerasa termoestable (Taq)
• Purificada en 1976 de la bacteria Thermus aquaticus,
que vive en manantiales de agua caliente
(temperaturas comprendidas entre 50 y 80 °C) gracias
a que sus enzimas resisten tales condiciones

Yellowstone National Park

Termociclador: aparato en el que se
efectúa la PCR convencional.
 Programa de PCR
Paso Temperatura Tiempo Nº Ciclos
1 Desnaturalización
94ºC 5 min 1
inicial

2 Desnaturalización 94ºC 15 seg

3 Hibridación 65ºC 30 seg 30
4 Extensión 72ºC 30 seg*
5 Extensión final 72ºC 10 min 1
6 Conservación 4ºC ∞ 1

* 1 min por 1kb

 ELECTROFORESIS
Los productos de PCR se resuelven en geles de
agarosa o poliacrilamida
 ELECTROFORESIS

1. Marcador
2. Control negativo (sin ADN) = blanco
3 y 5. Individuos PCR negativos
4, 6, 7, 8 y 9. Individuos PCR positivos (banda de 280 pb)
 Ventajas de la PCR

• ESPECIFICIDAD: solo se amplifica la región

comprendida entre la zona de hibridación de los
cebadores

• SENSIBILIDAD: detecta una molécula de ADN y la

amplifica hasta obtener millones de copias

• RAPIDEZ: los resultados se obtienen en pocas horas

APLICACIONES DE LA PCR
DIAGNOSTICO DE LA COVID-19
DIAGNOSTICO DE LA COVID-19
DIAGNOSTICO DE LA COVID-19
DIAGNOSTICO DE LA COVID-19
 LightCycler

1. 3.

2.
4.
 APLICACIONES CLÍNICAS DE LA PCR
para la detección de enfermedades genéticas
-Diagnóstico genético prenatal: a partir de una muestra de
líquido amniótico.
-Individuos nacidos con síntomas específicos: diagnóstico
inequívoco de la enfermedad (a partir de muestras de sangre) y,
por tanto, la elección del tratamiento más adecuado y efectivo.

Distrofia muscular de Duchenne

Deleciones en el gen de la Distrofina, proteína que conecta los

filamentos de actina.
 APLICACIONES CLÍNICAS DE LA PCR
para la detección de enfermedades genéticas
Distrofia muscular de Duchenne
PCR multiple

Del patrón de bandas se infiere las regiones (exones) delecionadas

(+ = varón normal; de 1 a 5 son varones afectados de DMD)
 APLICACIONES DE LA PCR
en la industria alimentaria
-Detectar variedades transgénicas, patógenos o identificar ingredientes
alérgenos (gluten, huevo, frutos secos,…) con el objetivo de hacer un control
de calidad y de cumplir la normativa en el etiquetado de productos.

Fraude alimentario en
productos cárnicos
procesados (Fraude de
“carne de caballo”, 2013)
 APLICACIONES DE LA PCR
en Genética Forense

Pruebas de Criminalística Identificación

paternidad restos óseos
 VNTRs
Variable Number of Tandem Repeats
Microsatélites: unidades de repetición de 1-13pb, se distribuyen
por todo el genoma y ocupan menos de 150pb.
...5’GTAAGTAAGTAAGTAAGTAAGTAA 3’ …

...5’ GTAA GTAA GTAA GTAA GTAA GTAA 3’ …

Bloques de distinto tamaño que constituyen los distintos alelos

Para detectar los diferentes alelos recurrimos a la PCR
 VNTRs
Variable Number of Tandem Repeats
IDENTIFICACIÓN DE INDIVIDUOS
M M M

M: marcador de peso molecular

Con varios microsatélites: perfil electroforético exclusivo de

cada individuo (como un código de barras).
 DNA fingerprint o huella genética

La mayor parte de la variabilidad en el ADN se da en regiones no codificantes

(90% del genoma) y no se manifiesta como una variación en el fenotipo
 Alec Jeffreys 1984
Universidad de Leicester
 VNTRs
Variable Number of Tandem Repeats
PRUEBAS DE PATERNIDAD
Consenso en los marcadores utilizados
CODIS (Combined DNA Index System)

Short Tandem Repeats

Toma de muestras de ADN

hisopo
OCTUBRE 2021
Caso práctico:
Crimen con violación:
-heridas arma blanca
-sangre en uñas de la victima
-semen en su cuerpo
-sangre por la habitación
El abogado

El portero

El novio
¿Quién es el autor del crimen?
Introduction to Genetic Analysis
A. Griffiths
Genética. Conceptos esenciales
C. Benito y J. Espino

www.dnai.org