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Extracción de Ácidos

Nucleícos.

Blgo. Félix J. Alvarez A.


(e) Maestría en Genética Humana – UPCH

Clase 05
Genética de los Virus

2
Genética de las Bacterias.

3
Genética de los Hongos.

• Organismo
Eucariota.
• Haploides (n) o
diploides (2n).
• Incluso pueden
tener
Heterocariosis.
• Cromosomas
lineales.

4
¿Qué es Biología Molecular?
DOGMA DE LA
BIOLOGIA
MOLECULAR

ADN
ARN

Expresión del gen. GENES (información)

5
Extracción de Ácidos Nucleicos.
¿De dónde podemos extraer el ADN/ARN?

Sangre Periférica Tejido fresco


Suero/Plasma

Bloque Para finas Otros…

6
Técnicas de Extracción de Ácidos Nucleicos
1. Tipo de microorganismo de estudio.
2. Tipo de ácido nucleíco.
3. Cantidad y calidad del ácido nucleíco.
4. Prueba molecular a realizar posterior a la extracción.
5. Disponibilidad de los reactivos.
6. Equipamiento del laboratorio.

7
Esquema general de una Técnica de
Extracción de Ácidos Nucleícos.

8
Técnicas de Extracción de
Ácidos Nucleicos
1. Salting Out.

2. Fenol / Cloroformo / Alcohol Isoamílico.

3. Kits comerciales (Columnas de gel de silice).

9
Estandarizar y elegir técnica
de Extracción.

10
Estandarizar y elegir técnica.

11
Amplificación del ADN - PCR
¿Qué componentes se necesitan para una Reacción en Cadena de la
Polimerasa (PCR)?

Primers Forward / Reverse

Buffer con Mg2Cl


Enzima

Nucleótidos (A,C,G, T)

ADN extraído

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Esquema de la PCR

13
Amplificación del ADN:
Etapas del PCR

25 – 30 ciclos

14
Tipos de Reacción en Cadena de Polimerasa
• PCR punto final:
1. Nested PCR: Amplificas 2 veces.
2. Multiplex PCR Se usan 2 juegos de primers.
3. Touchdown PCR T° disminuye ciclo a ciclo.

• PCR en Tiempo Real.

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Assembly (Polymerase Cycling Assembly or PCA) PCR
Asymmetric PCR
Co-Amplification at Lower Denaturation Temperature (COLD) –PCR
Colony PCR
Digital PCR (dPCR)
High Fidelity PCR
Hot Start/cold finish PCR TECNICA
InterSequence-Specific (ISSR) – PCR MOLECULAR
Inverse PCR
Linear-After-The-Exponential (LATE) – PCR
Long-PCR
Methylation-specific PCR (MSP)
Multiplex-PCR
Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)
TEST DE
Nested PCR
Semi Nested PCR DIAGNOSTICO
Quantitative/Real-Time (q) PCR
HRM Real-Time (q) PCR
Round A/Round B (R) – PCR
Splicing by overlap/overhang extension (SOE) PCR
Thermal Asymmetric InterLaced (TAIL) – PCR
Touchdown PCR
Whole genome amplification
Visualización del ADN amplificado.

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Evaluar la PCR realizada.

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Aplicaciones Diagnósticas.
1. Detectar mutaciones genéticas.
2. Detección de patógenos en muestras biológicas.
3. Presencia, expresión y seguimiento de oncogenes.
4. Análisis de parentesco (paternidad).
5. Pruebas criminalísticas.
6. Estudios arqueológicos.

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Detección de patógenos en muestras
biológicas.

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Secuenciamiento de genes (SNP)
• Polimorfismo de un solo nucleótido (SNP)

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Secuenciamiento Masivo.

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Estudios realizados (1)

Materiales clínicos: sangre 2 a 3 mL


Extracción artesanal.
PCR anidada diseñados por Bialek et al
Cebadores HcI y HcII (391pb)
Cebadores HcIII y HcIV (210pb)
Proteína 100kDa involucrada en infección y supervivencia.
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PCR + 87%
Hemocultivo 37%
25
Estudios publicados (4)

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Extracción de RNA
Consideraciones especiales:

RNAsas
(uso de inhibidores de
RNAsas)

pH
(pH 5-6 para RNA, pH 8 para
DNA)
Tipos principales de RNA
en la célula

RNA mensajero (mRNA):  1-5%


(sirve como molde para la síntesis de proteinas)

RNA ribosomal (rRNA):  80%


(componente estructural de los ribosomas)

RNA de transferencia (tRNA):  10-15%


(participa en la síntesis de proteínas)
¿Para qué extraer RNA?

➢Tamaño (estudiar distintas formas de splicing)

➢Secuencia (predecir un producto proteico)

➢Abundancia (medir los niveles de expresión)

➢Dinámica de expresión (temporal, tejido-


específica, etc).
Protocolos de extracción
de RNA
Extracción orgánica Extracción por afinidad
(solventes orgánicos) (columnas)

Extracción con oligo(dT)


(para mRNA)
Visualización de RNA en gel
➢ Geles desnaturalizantes ➢ Condiciones libres de RNAsas
Gracias por su atención.
Felix.alvarez.a@upch.pe

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