Métodos de Detección y Cuantificación Isótopos

Nucleido
ó Defecto
neutrón
Núclido Másico

protón
A
Z X ∆m
A: nº. másico = n + p+
Z: nº. atómico = p+

Densidad Ee=∆m·c2
nuclear ≈ 2.5·10 g/cm = 250 millones Tm/cm (!!!)
14 3 3

Defecto másico insuficiente ⇒ Núclido Inestable ⇒ Desintegración nuclear

Cuándo?
Cómo?
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 Para un elemento químico dado (ej.: C) puede haber diferentes composiciones n

u nucleares (núclidos) que se diferenciarán en su número de neutrones (ej.: 12C, 13C, 14C).
 Todas ellas son formas del mismo elemento (Z=6) que ocuparán, por tanto, la misma p
o posición en el sistema periódico: Isótopos.
 Tendrán, por tanto, la misma reactividad química, lo que implica que pueden i n t e r c a
m intercambiarse unos por otros sin modificar el comportamiento químico/bioquímico de l
a la molécula de la que formen parte.
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 Isótopos Estables: los que tienen núclidos estables. Ej.: el 13C es un isópo estable del 12C.
 Isótopos Radiactivos: aquellos cuyo núclido es esencialmente inestable y tiende a des i
nt desintegrarse, emitiendo radiactividad. Ej.: el 14C es un isópo radiactivo del 12C.
 La radiactividad es un fenómeno natural que puede
detectarse y cuantificarse captando con equipos
adecuados las emisiones de los núclidos inestables
(ej.: detectores Geiger).
 En condiciones normales esta radiactividad natural
es poco intensa y de baja energía, pero es posible el
enriquecimiento en isótopos radiactivos de una
muestra, o incluso su producción artificial, con lo que se
dispondrá de marcajes, fácilmente rastreables, para la
detección y cuantificación muy sensible de los
compuestos biológicos.
 La desintegración radiactiva es un proceso espontáneo que puede cuantificarse
midiendo el número de desintegraciones por unidad de tiempo que se producen en una
muestra (cada emisión radiactiva captada, α, β, ó γ, corresponde a la desintegración de un
núclido).
 A la velocidad de desintegración de una muestra radiactiva se le llama Actividad .
 El tiempo que tarda en reducirse a la mitad el número de núclidos radiactivos de una
muestra se conoce como período de semidesintegración (t1/2).
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 El carácter espontáneo (monoatómico) de la desintegración radiactiva da cuenta de que la
actividad absoluta, A, de una muestra sea proporcional a su número de átomos radiactivos, N.
A = λ·N λ, constante de desintegración; expresa la probabilidad por segundo de
que un núclido radiactivo se desintegre.

N = No·exp(−λ·t) ⇒ t1/2 = ln2/λ

Unidades de Actividad radiactiva
A = Ao·exp(−λ·t)
Actividad absoluta, A
No • Becquerel (Bq); 1 Bq = 1 dps (S.I.)
El número de átomos radiactivos, N,
Número de átomos radiactivos

desintegraciones por segundo

y, por tanto, la actividad, A, de una
muestra radiactiva, decaen
exponencialmente con el tiempo
No/2
No/4
• dpm
• Curio (Ci): 1 Ci = actividad de 1g de 226Ra
1 Ci = 3.7×1010dps
Para medir A se emplean los contadores de
radiactividad, que, en esencia, van contando
las desintegraciones conforme se producen.
Surge así la …

No/8 Actividad relativa, R

• cpm, cps (cuentas por minuto, …)
(actividad referida a
t1/2 2t1/2 3t1/2 Actividad específica, S la unidad de masa)
tiempo • dpm/g, Ci/mol, cpm/mg, …
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Isótopos de Interés en Biología Marcaje de Biomoléculas
 Sustitución de uno o más átomos de la molécula por isótopos
radiactivos. (e j.:
(ej.: marcaje de ácidos nucleicos)
 Adición de isótopos radiactivos ala molécula de interés,
evitando modificar sus propiedades químicas y biológicas.
(ej.: marcaje de proteínas)
 Dada la elevada sensibilidad de la detección de radiactividad,
es posible introducir el marcaje en proporciones ínfimas (sólo
una fracción muy reducida de las moléculas resultarán
realmente modificadas).

* NTP*
*
Cloramina T
125I −
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CONTADORES DE RADIACTIVIDAD Líquido de
vial de Cadena de arrastre
Centelleo
contaje

Fotomultiplicador Fotomultiplicador

Unidad de
medida

Cristal de
Centelleo

Eficacia de recuento: E = (R/A)×100 (<100%)

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RADIOINMUNOENSAYO (RIA): Método de cuantificación de biomoléculas que combina la
sensibilidad de las medidas de radiactividad con la especificidad de las reacciones inmunes.
 Es aplicable a la cuantificación de cualquier biomolécula que tenga propiedades in m
un inmunogénicas por sí misma, o en combinación con una proteína transportadora.
 Los métodos radioinmunométricos se basan en la competición que se establece entre
el el antígeno no marcado (Ag) y una cantidad determinada del antígeno marcado (Ag*) p
o por los sitios de unión de un anticuerpo (Ab) presente en cantidades limitadas.
Ag* Ab Ag* Ab Ag* Ab

Ag Ag

Radiactividad Precipitado
[Ag]=0 [Ag]=C1 [Ag]=C2

Ab2 (anti-Ab) Ab2 Ab2

Sbdte.
(Ag libre) 0 C1 C2
Precipitado Concentración Ag
(Ag unido)
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AUTORRADIOGRAFÍA: Detección de moléculas marcadas radiactivamente, basada en la
capacidad de las emisiones radiactivas para impresionar películas fotográficas.

Cassettes de
Autorradiografía.
Protegen a la película de Inmunodetección de Proteínas:
radiaciones externas
Marcaje con 125I

Secuenciación de DNA: Marcaje con 32P Anticuerpos

policlonales
de conejo

Sueros de
pacientes
alérgicos
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AUTORRADIOGRAFÍA: Detección de moléculas marcadas radiactivamente, basada en la
capacidad de las emisiones radiactivas para impresionar películas fotográficas.
Localización de Colonias de
Se crecen las Bacterias en Placas Petri
colonias en una
placa

Se hace una
réplica Las colonias se transfieren a una DNA desnaturalizado
membrana de nitrocelulosa unido a la superficie de la membrana

Autorradiografía
Se prepara una sonda radiactiva
de secuencia complementaria a
la que se pretende localizar

La sonda se hace hibridar

con el DNA del filtro Autorradiografía del filtro
Sólo impresionan
Las
Autocolonias positivas
la película las
aparecen como manchas
colonias con DNA
Autorradiografíaoscuras complementario a
la sonda radiactiva