Dx genético molecular

@_VIVIENDOLAMEDICINA
Un poco de
contexto....
1) Proyecto Genoma Humano
2) Disponibilidad de pruebas
comerciales
 MUESTRAS
Marcadores genéticos
Segmento de ADN con una ubicación
física conocida en un cromosoma

CONSTITUTIVOS SOMÁTICOS
Presentes en todas las células de Restringidos a tipos tisulares o
la persona afectada. lesiones concretas.
 ADQUIRIDAS
Indicaciones

PRENATAL POSTNATAL ÉPOCAS TARDÍAS

+ Malformaciones
+ Edad avanzada de la madre + Síndromes de cáncer
congénitas múltiples
+ Progenitor portador hereditario
+ Síndrome metabólico
+ Anomalías fetales + Enfermedades
+ Retraso mental o del
+ Pruebas sanguíneas monogénicas atípicamente
desarrollo no explicados
maternas que indiquen riesgo leves
+ Sospecha de enfermedad
+ Alteraciones en un hijo + Trastornos
monogénica
anterior neurodegenerativos
PCR Amplificación masiva del DNA a partir de DNA.
Alteraciones de la secuencia del DNA.

1) Desnaturalización
2) Hibridación
3) Elongación

+ Secuenciación de Sanger
+ Pirosecuenciación
+ Extensión del cebador de una base
+ Análisis de longitud de fragmentos de restricción
+ Análisis de longitud del amplicón
+ PCR en tiempo real
Secuenciación de Sanger
Frederick Sanger

+ Análisis de genes largos o múltiples

+ Ocupa dideoxinucleótidos
(marcadores fluorescentes)
+ Electroforesis
+ A partir de esta secuenciación se
hace el código genético
Pirosecuenciación Extensión del cebador

+ Por liberación de pirofosfato + Identificar mutaciones en una posición

+ Hay una reacción secundaria nucleotídica específica
+ Luciferasa: productora de luz
+ Fotodetector 1 - 2% de los alelos mutados

5% de los alelos mutados en un Desventaja:

contexto de alelos normales solamente
produce un par de
bases de datos
secuenciados
RFLP
Enzimas de restricción

+ Análisis de longitud de fragmentos de

restricción
+ Digestión de DNA con endonucleasas
(enzimas de restricción)
+ Secuencias específicas de DNA
+ Electroforesis
+ La mutación está en una posición
nucleotídica invariable
 Análisis de longitud del
RFLP amplicón
Enzimas de restricción
+ Detectar mutaciones que afectan la longitud
del DNA
+ Análisis de longitud de fragmentos de + Electroforesis
restricción + En alguno casos se tiene que realizar un
+ Digestión de DNA con endonucleasas análisis de inmunotrasferencia de Southern
(enzimas de restricción)
+ Secuencias específicas de DNA
+ Electroforesis
+ La mutación está en una posición
nucleotídica invariable
PCR en tiempo real

+ Indicadores fluoróforos
+ Amplifica y cuantifica simultáneamente
+ Ves los ciclos en una gráfica
+ Frecuencia de células cancerosas
+ Carga infecciosa de ciertos virus
+ Detectar mutaciones puntuales
FISH
MUESTRAS Hibridación in situ fluorescente.
Alteraciones genómicas.

+ Muy útil para diagnósticos rápidos

+ Alteraciones numéricas en cromosomas
+ Microdeleciones sutiles
+ Translocaciones complejas no
detectadas en un cariotipo convencional
FISH Hibridación in situ fluorescente.
Alteraciones genómicas.
MLPA Southern Blot

+ Amplificación de sondas dependiente de + Cambios en la estructura de loci

ligandos múltiples específicos
+ Detecta deleciones y duplicaciones de + Detección de enfermedades por
cualquier tamaño. expansión de trinucleótidos amplios
+ Electroforesis
+ Una sonda en el sitio de una deleción
heterocigota genera solo un 50% de la señal

https://youtu.be/LNVdOdNQyCM
Tecnología de matrices
citogenómicas

1) Hibridación genómica comparada

(CGH)
2) Genotipado de SNP
CGH Hibridación genómica comparada basada
en matrices

+ Microarreglos de expresión
+ Determinaciones muy precisas
de las variantes del número de
copias en el genoma.
Matrices de genotipado de SNP
USOS

CNV CIGOSIDAD

+ Polimorfismos de nucleótido único.

+ Los más frecuentes en el DNA.
+ Sirven como punto de referencia físico
dentro del genoma y como marcador
genético.
+ Son la base de los estudios de
asociación pangenómicos (GWAS)
 Marcadores de polimorfismos y
dx molecular

Ligamiento
1) SNP
2) Repeticiones de minisatélite o
microsatélite
Polimorfismos de longitud repetida

MICROSATÉLITES
- Miden menos de 1 kb
USOS

- Segmento repetido de 2-6

pares de bases

MINISATÉLITES
- Miden de 1-3 kb
- Segmento repetido de 15-70
pares de bases.
GWAS

USOS
Estudios de asociación pangenómicos
(Estudios de ligamiento a gran escala)
Epigenética Modificaciones del DNA, que no modifican la
secuencia del DNA en sí misma.

+ Expresión genética: islotes CpG.

+ ¿Cuál es la técnica?
Bisulfito sódico

+ Sx del cromosoma X frágil

+ Sx de Prader-Willi
+ Sx de Angelman
Análisis del RNA
1) Detección y cuantificación de virus
2) Estratificación molecular de tumores
 NGS Secuenciación de próxima generación

1) Separación espacial
2) Amplificación local
3) Secuenciación en paralelo
https://youtu.be/jFCD8Q6qSTM

+ Generar gran volumen de datos de secuencias de forma masivamente paralela.

+ Permiten efectuar análisis antes imposibles a un coste relativamente muy bajo.
Bioinformática

ALINEACIÓN DETECCIÓN DE VARIANTES

Las lecturas de secuenciación de
Se evalúan todos los datos de la
una muestra son ubicadas en el
secuencia
genoma de referencia adecuado

INTERPRETACIÓN
Las variantes interpretadas
pueden ser anotadas a partir de
distintas fuentes de información
Aplicaciones clínicas

1) Secuenciación dirigida
2) Secuenciación de exoma
completo (WES)
3) Secuenciación de genoma
completo (WGS)
Referencias
1. Kumar, V. (2021b). Robbins y Cotran. Patología estructural y funcional, 9a
ed. (9.a ed.). Elsevier España, S.L.U.
2. Espy et al., 2006 M.J. Espy, J.R. Uhl, L.M. Sloan, S.P. Buckwalter, M.F. Jones,
E.A. Vetter, et al. Real-time PCR in clinical microbiology: applications for
routine laboratory testing Clin Microbiol Rev., 19 (1) (2006), pp. 165-256
3. Cutting GR: Cystic fibrosis genetics: from molecular understanding to clinical
application, Nal Rev Gene/ 16:45-56, 2015.
4. Gudbjartsson DF, Helgason 1-1, Gudjonsson SA, et al: Large-scale
wholegenome sequencing of the lcelandic population, Nnl Gene/ 47:435-
444, 2015.