UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÉ MARÍA ARGUEDAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIAS BÁSICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

GUÍA DE PRÁCTICA N°
TINCIÓN GRAM

I. DATOS GENERALES
 ASIGNATURA : MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL
 ESCUELA PROFESIONAL: INGENIERÍA AMBIENTAL
 LABORATORIO : MICROBIOLOGÍA – DACB
 CICLO : IV
 FECHA :
 DOCENTE : Blga. Aydeé Marilú Solano Reynoso

II. COMPETENCIA
Conoce el proceso de la tinción Gram y clasifica algunas especies bacterianas en Gram
positivas o Gram negativas de acuerdo a la tinción de Gram.

III. MARCO TEÓRICO

REFERENCIA: https://www.youtube.com/watch?v=bdlKR0BBczE

De manera general, se denomina tinción al proceso y resultado de teñir y, en el área de la Microbiología

consiste en teñir células o microorganismos. Se trata de una técnica empleada en los laboratorios con
el objeto de optimizar la visión de aquello que se observa a través de un microscopio, por lo tanto,
consiste en aplicar un colorante al material en estudio para que resulte más simple detectar
determinados microorganismos. Las tinciones serán siempre uno de los aspectos más importantes y el
primer paso para la detección de microorganismos, pues una vez identificadas sus características como
morfología (cocos, bacilos, etc.) y agrupación (tétradas, cadenas, etc.), así como su clasificación (Gram
positivos, Gram negativos, etc.), será posible proceder a realizar las pruebas bioquímicas pertinentes.
Por lo tanto, el primer paso en toda determinación de microorganismos es realizar una correcta tinción.

La tinción de células es una importante herramienta usada en el área de la biología. Una de las tinciones
más conocidas en microbiología es la desarrollada en 1884 por Hans Christian Gram, bacteriólogo
danés, quien buscaba diferenciar entre dos bacterias que causaban neumonía. Este método ha
permitido hacer una clasificación de las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram
negativas, dependiendo de la capacidad que tengan para retener el colorante cristal violeta usado en la
tinción. El método es ampliamente utilizado en los laboratorios de microbiología, por ejemplo, en el
diagnóstico clínico permitiendo elegir al médico el antibiótico a usar. En procesos de fermentación se
usa como método rápido en control de calidad para verificar que los cultivos semilla no estén
contaminados, antes de inocular los fermentadores de mayor escala.
La tinción de Gram está fundamentada en la naturaleza química de la pared celular de las bacterias.
Pared Gram (+): Se destaca una capa densa y uniforme de 200 a 800 A˚ de Peptidoglicano (Mureina o
glicopéptido) representando el 50% del peso seco. Otros elementos de la pared son ácidos teicoicos y
ácidos lipoteicoicos. En menor medida polisacáridos y proteínas.
Pared Gram (–): El peptidoglicano o glucopéptido representa el 10% del peso seco formando una capa
interna delgada de 20 a 30 A°, cubierta por capas externas de lipopolisacáridos, lipoproteínas y
proteínas. Se reconoce una membrana externa (ME) con una bicapa lipídica asimétrica, atravesada por
canales proteicos de porina y con el Lipopolisacarido (LPS), en su cara externa.
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Representación esquemática de los componentes químicos de paredes bacterianas en función de su coloración

diferencial con la técnica de coloración de Gram.

IV. MATERIALES
- Microscopio óptico
- Mechero de alcohol
- Piseta con agua destilada
- 01 caja de portaobjetos y
- 01 caja de cubreobjetos
- 01 frasco de aceite de inmersión
- Asa de Kolle
- Papel secante
- Vaso de precipitado
- 01 set de coloración Gram
 Colorante primario: Cristal Violeta
 Mordiente: Lugol
 Decolorante: Alcohol Acetona
 Colorante de contraste: Safranina o Fucsina básica diluid
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V. ACTIVIDADES
PREPARACIÓN DEL FROTIS

Procedimiento:

- Coloca una pequeña gota de agua pequeña sobre un portaobjetos limpio y seco.
- Flamea el asa, enfriar en el agar y tomar una pequeña cantidad de una colonia, colocarla sobre la
gota y extenderla sobre la superficie, evitando que quede conglomerada.
- Para la muestra de cultivo líquido, tomar directamente la gota del cultivo con el asa previamente
flameada y enfriada y extender la muestra.
- Sujeta el portaobjetos con unas pinzas, pasar dos o tres veces durante un segundo el porta objetos
con la cara del frotis hacia arriba por la parte baja de la flama del mechero.
- Deja enfriar el portaobjetos entre los pases, para evitar que se queme la muestra.

TINCIÓN DE GRAM

Procedimiento:
1. Cubre la preparación del frotis con unas gotas de cristal de violeta durante un minuto.
2. Enjuaga suavemente rociando un pequeño chorro de agua sobre la parte superior del portaobjetos,
procurando no desprender la preparación, por presión del agua.
3. Después aplique lugol durante un minuto, lave suavemente con agua. El yodo es corrosivo evite el
contacto con la piel.
4. Decolora por 10 segundos con una mezcla de alcohol y acetona (1:1), y enjuagar rápidamente con
agua. Si no se retira rápidamente el decolorante desteñirá tanto a Gram positivas como Gram
negativas.
5. Posteriormente contrastar con safranina durante 45 segundos, y finalmente enjuagar con agua.
6. Observar al microscopio con el objetivo 100x, agregando aceite de inmersión para lograr una buena
resolución. Recuerde que primero tendrán que utilizar alguno de los objetivos de menor aumento.
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Coloración de Gram. Pasos de la tinción en base a cada uno de los productos que emplea y a la
reacción y coloración que va produciendo en las bacterias

VI. RESULTADOS
Dibujar y anotar los resultados para cada uno de los cultivos, tomar fotografías de las observaciones
realizadas si es posible.
Describe a los microorganismos observando su morfología, agrupación y color.
Analiza los resultados obtenidos, tratando de dar respuesta a las siguientes preguntas:
1. De acuerdo a la literatura, ¿cuál es el Gram de los cultivos estudiados en esta práctica?
¿Corresponde a lo observado aquí?
2. ¿Se puede identificar una bacteria solo con la descripción de su morfología colonial, celular y Gram?
Explica tu respuesta.
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VII. CONCLUSIONES

VIII. CUESTIONARIO
1. Describe la función de la pared celular en las bacterias.
2. Define los siguientes conceptos: tinción simple, tinción diferencial, negativa, selectiva, colorantes
básicos, colorantes ácidos y da dos ejemplos de cada uno de ellos.
3. ¿Cuál es la composición de las soluciones utilizadas para la tinción de Gram?
4. Describe brevemente el mecanismo de acción de la tinción de Gram.
5. ¿Cómo se pueden teñir las endosporas, capsulas y flagelos bacterianos? ¿Qué tipo de tinciones son?
6. ¿Cuál es el grosor aproximado de la capa de peptidoglicano en bacterias Gram negativas y Gram
positivas?
7. Ubica el peptidoglicano, membrana plasmática, externa, periplasma, interior y exterior de la célula en
los siguientes esquemas de pared celular. ¿Cuál es la Gram negativa y cuál es la Gram positiva en la
Figura ?

ESQUEMA DE LA PARED CELULAR BACTERIANA

8. ¿En qué se diferencian estructuralmente las paredes celulares de Archaea de las de Bacteria
9. Diga en cada cuadro, que color presentan las células bacterianas en el transcurso de la tinción de Gram.

10. Selecciona 10 microorganismos Gram – y 10 Gram + (incluye nombre y gráficos respectivos)

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11. Explique el mecanismo químico de la reacción de Ziehl-Neelsen y para qué tipo de microorganismos
se utiliza.
https://www.youtube.com/watch?v=h83U_DV-sME
Esquematice el procedimiento
12. Esquematice la pared celular de una bacteria BAAR y mencione a las bacterias de interés en este
grupo.

IX. BIBLIOGRAFÍA