PRÁCTICA 1. → MICROSCOPÍA.

I. EL MICROSCOPIO ÓPTICO (de luz):

Microscopio simple: presenta un solo lente.
Microscopio compuesto: sistema de lentes ópticos que amplifica la imagen sucesivamente.
1. Microscopio de campo claro: El que nosotros usamos. Instrumento utilizado para microscopía de rutina. El área
observada está iluminada y los objetos en estudio aparecen más oscuros. La amplificación con el uso de lentes.
Comúnmente tienen tres objetivos montados en un revólver. Objetivos de 4, 10, 40 y 100x. El poder de resolución
está determinado por la longitud de onda de la luz y por una propiedad del objetivo y del lente del condensador
Sistema mecánico: Base, brazo, platina, carro, tornillo macrométrico, tornillo micrométrico y tornillos de ajuste,
revolver.
Sistema óptimo: Tubo (aquí están los espejos), objetivos, oculares, condensador (condensa la luz), diafragma
(controla cantidad de luz).
Fuente de luz: Foco.
2. Microscopio de campo oscuro: Es similar al de campo claro, excepto que va equipado con un condensador de campo
oscuro y una abertura numérica baja. Todo se ve oscuro menos la muestra.
3. Microscopio de fluorescencia: Fuente de luz ultravioleta, varios filtros y un condensador de campo oscuro. Se usan
colorantes fluorescentes.
4. Microscopio de contraste de fases: Acentúa las ligeras diferencias en el espesor o en los índices de refracción de las
estructuras celulares. Las diferencias se revelan en forma de distintos grados de brillo o de oscuridad. No necesita
teñir.
II. EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO.
Emplea haces de electrones. Un campo magnético. Amplificaciones de un millón de veces, y después se logran ampliar más
en la imagen fotografiada. Hace posible la observación de microorganismos pequeños no visibles en el óptico.
1. Microscopio electrónico de transmisión:
Un haz de electrones pasa a través de un corte ultradelgado. Los electrones son enfocados a una pequeña área de la
muestra y la iluminan, apareciendo con áreas claras y oscuras. La amplificación es de 10 000 a 100 000 X.
2. Microscopio electrónico de barrido:
Permite observar células completas. Unos electrones son dirigidos a la superficie de la muestra y otros colectados
para formar la imagen tridimensional.

PRÁCTICA 2. → AISLAMIENTO DE BACTERIAS Y MEDIOS DE CULTIVO.

La Microbiología es la ciencia que estudia los seres vivos de tamaño microscópico. «mikros "pequeño” y bios “vida”».
Estudia virus, bacterias, hongos y parásitos. 3 dominios Archaea, Bacteria y Eucarya, se incluye a todos los seres vivos.
1. DOMINIO BACTERIA: Son células procariotas. Presentan una pared celular conteniendo peptidoglicano, sensibles
a antibióticos antibacterianos tradicionales, y regiones del RNAr y del RNAt diferentes de las Archaea y Eukarya.
Hay muchas Bacterias es casi imposible determinar cuántas existen.
2. DOMINIO ARCHAEA: Organismos unicelulares (procariotes semejantes a bacterias). El material genético no está
encerrado en un núcleo. Las Bacteria y las Archaea son los únicos procariotas. Pared celular que no contiene
peptidoglicano. Son sensibles a los antibióticos que afectan a los Eukarya. Viven en ambientes extremos.
3. DOMINIO EUKARIA: Incluye protistas (algas y protozoarios), los fungi (hongos), el reino Plantae (plantas) y el
reino animalia (animales), organismos con células eucarióticas, membrana similar a Bacteria. No todos los Eukarya
presentan pared celular y cuando tienen no tiene peptidoglicano. Las células organizadas en tejidos.
LAS BACTERIAS.
Son células procariotas. Aproximadamente 1 micrómetro de diámetro. Se encuentran en los hábitats de las eucariotas.
Las células bacterianas muestran tres regiones arquitectónicas: apéndices en forma de flagelos y pili; envoltura celular
(membrana plasmática, pared celular y cápsula); y región citoplásmica que contiene el ADN y ribosomas.
Una técnica útil es la tinción de Gram y después se utiliza el microscopio para estudiar forma, tipo de agrupación y color.
Propiedades genéticas y fisiológicas utilizadas para definir características de las cepas. El material genético se emplea en
identificación de subgrupos de genes esenciales para el crecimiento, colonización, adhesión.
CULTIVO DE LOS MICROORGANISMOS.
El crecimiento de microorganismos no se puede estudiar individualmente, por su tamaño, por lo que es necesario su cultivo
en medios nutritivos artificiales, donde se puedan desarrollar rápidamente y producir grandes poblaciones. Los materiales
nutritivos donde se desarrollan y multiplican contienen los nutrientes necesarios para su crecimiento y son medios de cultivo.
Los medios son ricos en proteínas no específicas, el fin es estimular el crecimiento de los microorganismos que se desean
aislar. La mayor parte de los microorganismos requieren medio enriquecido por sangre, suero, vitaminas, etc.

• Medios de cultivo sintéticos: son medios de composición química conocida.

• Medios de cultivo complejos: en estos medios por lo menos hay un componente de composición desconocida.
• Medios líquidos y sólidos: cualquier medio líquido se pueden transformar en sólido, mediante la adición de agar, lo
que significa que conservan la misma fórmula química nutritiva.
• Medios selectivos: Los medios de cultivo que pueden contener sustancias inhibidoras de ciertos grupos microbianos,
sin interferir con otros. Cuando hay una muestra de una parte cuerpo que tiene flora normal que puede inhibir a los
m.o patógenos, por lo que se tiene que sembrar en un medio que inhiba la flora normal. Ej. Shigella-Salmonella-
agar (SS), citrato-desoxicolato-agar y sulfito de bismuto-agar, inhiben el crecimiento de coliformes y permite
patógenos entéricos. Agar-sangre es selectivo para aislamiento de cocos gran+. Los medios con telurito de potasio
y con suero o sangre favorecen el aislamiento de Corynebacterium. En sal-manitol-agar las colonias de estafilococos
patógenos crecen con un halo amarillo.
• Medios diferenciales: La adición de algunas sustancias indicadoras al medio, que permiten el desarrollo de las
bacterias con una apariencia colonial distintiva, según la especie. Ej. agar-eosina-azul de metileno (EMB) y agar-
MacConkey contienen lactosa y un colorante o un indicador de pH.
• Medios para identificación de bacterias: Contienen sustratos específicos de prueba, para diferenciar unas especies
de otras, en base a su capacidad enzimática.
• Medios con antibióticos: Los medios con antibióticos son inhibitorios para unos organismos, permitiendo el
aislamiento de otros, a partir de una población mixta. Ej. agar-Sabouraud con cicloheximida y cloranfenicol, permite
el crecimiento de hongos dermatofitos y patógenos, e inhibe a los hongos saprófitos y bacterias.
• Medios de mantenimiento: Contienen los requerimientos necesarios para conservar las cepas bacterianas puras en
el laboratorio, haciendo resiembras periódicas.
• Medios especiales: Deben permitir el crecimiento de grupos poco comunes de bacterias, como anaerobios estrictos,
mycobacterias, mycoplasmas.
• Bacterias no cultivables: Bacterias no cultivables no se pueden cultivar en ninguno de los medios conocidos
(Rickettsia, Chlamydia).

➢ Inóculo: El material bacteriano que se siembra en el medio de cultivo.

➢ Cultivo: Una vez que los microorganismos se desarrollan en el medio de cultivo.
➢ Aislamiento de las bacterias en medio de cultivo sólido: Cuando las bacterias se inoculan en un medio solidificado,
las bacterias pueden esparcirse en la superficie (estriado), para que las células queden separadas individualmente,
lejos unas de otras.
➢ Colonia bacteriana: Las colonias bacterianas son masas bacterianas observables a simple vista, excepto las del
género Mycoplasma. Cada colonia procede de una bacteria progenitora.
➢ Cultivo puro: Una colonia que se desarrolló separada de las otras, al ser transferida a un medio de cultivo nuevo,
dará lugar a un cultivo puro (individuos de una sola especie, de un solo progenitor).
PRÁCTICA 3. → ESTUDIO MICROSCÓPICO DE LAS BACTERIAS.
En cuanto a su forma, las bacterias se agrupan en tres tipos principales: bacilos, cocos, comas y helicoidales. Los cocos
pueden estar solas, pares, tetradas, cadenas o racimos. Los bacilos también en dos o en cadenas.
El estudio microscópico de las bacterias se facilita notablemente al tratarlas con colorantes o tintes, apreciándose su forma
y tamaño.
Preparación en fresco: Permite observar en los microorganismos la movilidad, el color, el tamaño, la forma y la agrupación
en su forma natural viva y sin alteraciones. Una forma es la reparación en gota suspendida. Porta objetos con solución salina,
agregar la bacteria, cubrir con cubreobjetos.
TÉCNICAS DE TINCIÓN:
- Tinción de Gram: Frote de bacteria. Secar y fijar. Cristal violeta (1 min), yodo-lugol (1 min), alcohol acetona (30 seg)
y safranina (1 min). E. coli, S. aureus, B. subtilis.
- Tinción negativa para observar cápsula: Gota de tinta china con bacteria. Extender preparación como frotis sanguíneo.
Secar. Safranina por 1 min y lavar. K. pneumonae, E. coli.
- Tinción de endosporas: Frote. Secar y fijar. Cubrir con papel filtro y con verde de malaquita en solución acuosa de
fenol y calentar a emisión de vapores por 5 min. Enfriar, retirar papel y lavar. Safranina por 1 min. Lavar y secar. B.
subtilis.

PRÁCTICA 4. → MICROFLORA NORMAL HUMANA.

Son microorganismos que normalmente existen en el cuerpo y su presencia no debe ser indicación de enfermedad.
La contaminación microbiana inicia en el nacimiento y continúa al respirar y al alimentarse. Está en superficies anatómicas,
como tracto digestivo, respiratorio, genitourinario, piel y oído externo. Sólo son superficiales y no en interior de tejidos.
La flora normal se encuentra constante en un sitio dado, en edad dada y compuesta por grupos fijos, permanece sin alterarse.
Si se trastorna, se vuelve a restablecer. Si sufre alteraciones o es eliminada, los microorganismos patógenos aprovechar la
situación y proliferar, llegando a enfermedad. La microflora puede contribuir en funciones útiles. Ej. la flora intestinal
sintetiza varias vitaminas y ayuda en la digestión de alimentos.
Flora bucal y piel: Con hisopo extraer sarro y depositar en tripticasa-agar-soya y extender con asa. Incubar. Hacer lo mismo
con la mano, pero el hisopo impregnado con solución salina.

PRÁCTICA 5. → CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS.

Los microorganismos pueden ser eliminados, inhibidos por agentes físicos, procesos físicos o agentes químicos. Los
métodos de esterilización causan la destrucción total de todas las formas de vida. En la desinfección no se logra esto.

• Agente físico: Temperatura, presión y radiación son ejemplos de agentes físicos que actúan sobre los microorganismos.
• Procesos físicos: Esterilización e incineración conducen a la muerte. En higienización, lavado los desprende de
materiales.
• Agente químico: es una sustancia (sólida, líquida o gas) que causa una reacción en los microorganismos. Ej.
compuestos fenólicos, alcoholes, cloro, yodo y óxido de etileno. Dependiendo de concentración y tiempo de
exposición, los daña o mata.
Físicos: Cultivo de E.coli y B. subtilis previamente calentado. E. coli sin temperatura constante y B.subtilis produce esporas.
La Luz UV no permite que haya crecimiento de E. coli.
Químicos: Tapete de bacterias con círculos con antibióticos, detergentes, etc. Ciproxina funcionó mejor.
PRÁCTICA 6. → COCOS GRAMPOSITIVOS.
El tracto respiratorio superior es rico en microorganismos de flora normal, estreptococos, estafilococos, neisserias,
difteroides, levaduras y bacilos entéricos Gram-. Los cocos gran+ patógenos se aíslan en agar enriquecido y suplementado
con sangre de carnero. Algunas especies presentan capacidad hemolítica.
Staphylococcus. S. aureus es el único coagulasa+ y forma grandes colonias cremosas y con pigmentación amarilla (incuba
a temperatura ambiente) y es betahemolítico. Muy resistente al calor, luz, desecación, temperaturas extremas, agentes
químicos, sobrevive semanas o meses en polvo, pus o esputo. Es tolerante a altas concentraciones de sales, sobrevivie en
alimentos preservados. En sal-manitol desarrolla colonias amarillas de 3mm y vira el indicador del pH a amarillo. Resistente
a la penicilina. S. epidermidis es coagulasa-, no-hemolítico.
El género Streptococcus antigénicamente, presenta 13 grupos en base al carbohidrato C de la pared celular y son
denominados de la A a la O.

• Los estreptococos del Grupo-A, Streptococcus pyogenes, colonias de 1-2 mm, sin color, transparentes, beta
hemolíticas y son los más virulentos. Sensibles a la Bacitracina.
• Los estreptococos del Grupo-B, S. agalactiae. Prueba de CAMP positiva: una hemólisis marcada en forma de punta
de flecha en el punto de unión de su crecimiento con S. aureus.
• Streptococcus faecalis (gpo. D) es el único que crece en EMB. Tubo con agar bilis esculina.
• Streptococcus pneumoniae (Diplococcus pneumoniae) es conocido como neumococo y desarrolla colonias de 1-3 mm,
apigmentadas, alfa hemolíticas en condiciones aerobias y beta hemolíticas en anaerobiosis.
I. Cepas puras de cocos gran+: Sembrar S. aureus en agar sangre e incubar. Hacer gran y observar la agrupación
de cocos.
II. Exudado faríngeo: Exudado faríngeo con un hisopo y depositar en agar sangre. Incubar y ver hemolisis
III. Identificación de genero Staphylococcus. Prueba de coagulasa. Bhemolitica. Si hay formación de coágulos es
+. Catalasa sumergir colonia en agua oxigenada. Si hay burbujas es +. Agar-sal-manitol: Inhibición parcial/total
a organismos diferentes a estafilococos.
IV. Identificación genero Streptococcus. Grupo A (S. pyogenes) prueba de bacitricina. Grupo B (S. agalactiae)
Punta de flecha. La hudrolisis de esfingomielina sensibilita al eritricito a CAMP lo que aumenta en área de
hemolisis. Grupo C (S) sensibilidad a trimetroprim sulfametoxazol. Grupo D (s) Tubo con agar bilis esculina.
Hidroliza la escuelina, esto causa el cambio de color a uno café o verde oliva. S. pneumoniae agar sangre con
optoquina.