Práctica N°4

TEMA: TINCIÓN DE GRAM Práctica Nº: 4

1. INTRODUCCIÓN:

Existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro del campo de la
microbiología entre ellas la tinción de Gram destaca en la clasificación de bacterias.
La tinción de Gram es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios
donde se manejan pruebas microbiológicas. Está definida como una tinción diferencial,
ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias
Gram negativas y bacterias Gram positivas. Fue desarrollada por el científico danés Hans
Christian Gram en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más utilizadas
universalmente debidas a lo económico, sencillas y eficaz que resulta.

Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared

celular de las bacterias, la cual le confiere propiedades determinantes a cada
microorganismo. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por
una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las
bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano,
pero no cuentan con membrana celular externa; así pues, la composición química y el
contenido de peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram negativas y Gram
positivas explica y determina las características tintoriales

En la presente práctica aprenderán una técnica para el aislamiento de bacterias en

sustratos ambientales.

OBJETIVO: Que el alumno conozca los principales técnicas y materiales para el

aislamiento la determinación de Bacterias en sustratos ambientales
a. OBJETIVOS ESPECÍFICOS Nivel*
Desarrolla habilidades en la manipulación de Bacterias en A
diferentes sustratos
Realiza aislamiento microbiano de Bacterias en sustratos A
ambientales
Identifica características e importancia del aislamiento de M
Bacterias en sustratos ambientales
*Alto(A), Medio (M), Bajo (B)

2. DEFINICIONES:

COLORANTE: Sustancia empleada para dar color

CONTRATINCION: Proceso de teñir con dos colorantes o mas
PEPTIDOGLICANO: Son aminoazúcares unidos entre sí formando una estructura de
soporte o pared
MICOPLASMAS: Es un género de bacterias que no tienen una pared celular alrededor de
sus membranas celulares.

3. BASE CONCEPTUAL:

La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual
tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca
lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación
de un complejo cristal violeta/yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la pared
bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la
pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la membrana externa
de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble a la acción de solventes
orgánicos, como la mezcla de alcohol/acetona. Las bacterias Gram positivas, al contener
una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo, mientras
que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano.
Por último, se coloca safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de
contratinción y sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal
violeta-yodo.

Hay bacterias de un mismo género que pueden observarse en la misma muestra como
Gram positivas y como Gram negativas, a este evento se le llama tinción Gram variable
secundaria a alteración en nutrientes, temperatura, pH o concentración de electrolitos.
No todas las bacterias se pueden teñir por esta técnica ya que carecen de pared celular
(micoplasma) o su pared celular tiene una composición química diferente (micobacterias,
que cuentan con una gran cantidad de ácidos micólicos)

4. ACTIVIDADES PREVIAS:

1. Prepare los medios de cultivos y materiales necesarios para la práctica con su

grupo.
2. Realice lectura del siguiente link:

3. Realice las siguientes preguntas de la web del profesor

https://goo.gl/forms/GgWnxahpGLY1rDsn1

5. MÉTODO/PROCEDIMIENTO

El profesor explicara los principios generales de trabajo en el laboratorio de Microbiología,

enfatizando en los equipos y materiales necesarios para el trabajo cotidiano con
microorganismos. También hará las demostraciones necesarias para que el estudiante
aprenda a manipular estos materiales y equipos en condiciones asépticas

2. Marcar los PORTAOBJETOS No. del grupo.

 3. Añadir el 1er colorante violeta cristal.
4. Esperar 2 min.
5. Eliminar el 1er colorante y añadir el lugol
6. Esperar 1 minuto.
7. Añadir el alcohol/acetona hasta decolorar la muestra
8. Enjuagar con agua
9. Añadir safranina

10. Dejar secar

11. Observar al microscopio

6. EQUIPOS Y MATERIALES:

Incluir el listado de equipos, materiales, (reactivos y muestras de acuerdo al laboratorio)

requeridos para la práctica.
1. Set de Gram
2. Alcohol
3. Portaobjeto
4. Microscopio
5. Papel de filtro

7. CONDICIONES DE SEGURIDAD:
 Uso de mandil cofia guantes y naso buco
 No comer en el laboratorio
 No realizar movimientos bruscos
 No conversar mientras se manipulan las muestras de ensayo

8. CUESTIONARIO DE INVESTIGACIÓN:

1. Describa la importancia de la tinción con de Gram.

2. ¿Cuáles son las ventajas y desventajas de la tinción de Gram?
3. Cite cuatro características específicas de las bacterias que permiten su
clasificación por la tinción de Gram
9. EVALUACIÓN DEL APRENDIZAJE: Aporte de la práctica para los resultados de
aprendizaje descritos.

Resultados de Resultados de aprendizaje Nivel del

aprendizaje de la de la asignatura aprendizaje de la
carrera práctica
1. Identifica y utiliza las 1.1. Conoce especies de M
técnicas de análisis las bacterias más
microbiológicos de importantes
sustratos ambientales e
interpreta objetivamente
los resultados obtenidos
 1.2. Analiza sustratos A
ambientales mediante
ensayos
microbiológicos

1.3. Diseña, analiza e A

interpretar datos
experimentales.

*Alto(A), Medio (M), Bajo (B)

10. EVALUACIÓN DE RESULTADOS OBTENIDOS:

Resultados obtenidos SI NO Observaciones

Ejecuta ensayos de control microbiológico x

Interpretar datos obtenidos x

experimentalmente.
Relaciona adecuadamente los la teoría con x
la practica

11. BIBLIOGRAFÍA:

PACHÓN, D. A.; PULIDO, A. P.; MORENO, C. A. Aislamiento e identificación de las

bactariasentéricos en muestras ambientales y cloacales en Crocodylus intermedius y
Testudines de la Estación de Biología Tropical Roberto Franco en Villav icencio,
Colombia. Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, 2010, vol.
57, no I, p. 23-34.

12. RÚBRICA DE EVALUACIÓN DE PRÁCTICA

PARÁMETRO PORCENTAJE DE OBSERVACIÓN

CALIFICACIÓN
Presentación,
Formato, Ortografía y 1
Redacción
Resultados y
5
discusión
Cuestionario 2
Conclusiones y 2
Recomendaciones
TOTAL 10
Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

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Lic. Tania M. Guzmán MsC Ing. Marco Jacome. MsC. Ing. Luis Reina. MsC
PROFESOR RESPONSABLE DE ÁREA COORDINADORA DE CARRERA
Fecha: 22/04/2019 Fecha: 22/04/2019 Fecha: 22/ 04/2019