GUÍA DE LABORATORIO DE BIOLOGÍA

Código: DO-BO-F-025 Versión: 01 Emisión: 13-06-2022 Página 1 de 9

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BÁSICAS

ÁREA Y
GUÍA
ESPACIO BIOLOGÍA GENERAL 4
N°
ACADÉMICO
TÍTULO DE LA PRÁCTICA DE LABORATORIO
REALIZACIÓN DE TINCIÓN DE GRAM EN BACTERIA

OBJETIVOS Y/O HIPÓTESIS

Utilizar un simulador para preparar una lámina con la muestra, realizar una tinción de gram, observar la
imagen y microscopio con el objetivo de 100X y reportar los resultados.

APLICACIONES
Identificación de bacteria a partir de los métodos de tinción

PREGUNTAS ORIENTADORAS
¿Qué importancia tiene el manejo de montajes húmedos en su campo profesional? Que
importancia el reconocimiento de las bacteria en su campo profesional

MATERIALES Y EQUIPOS
Material / Equipo Capacidad Cantidad
Computador
Acceso a internet

Elementos personales y de protección: (por el estudiante) no aplica

MONTAJE Y PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Una de las características más importante de las bacterias es su morfología, definida por el tamaño, la forma, el arreglo y la estructura.
Existen bacterias en forma redondeada denominadas cocos, en forma cilíndrica, denominadas bacilos y una tercera morfología como
son las que tienen forma de espirales, denominadas espirilos. A su vez cada categoría puede subclasificarse con base a diferentes
arreglos. Estas características pueden determinarse examinando muestras al microscopio. Las células no teñidas son prácticamente
transparentes, pero pueden observarse al microscopio de luz haciendo preparaciones entre lámina y laminilla o con microscopios
especiales como, por ejemplo: de contraste de fases o de campo oscuro. Cuando se dispone de un microscopio de luz, se pueden teñir
las bacterias para facilitar su visualización. Si se tiñe una muestra del cultivo extendida y fijada en una lámina portaobjeto con un
colorante dado, las células adquirirán el color del colorante añadido y podrá observarse la forma, tamaño y el arreglo de las mismas.
Este tipo de coloración se conoce con el nombre de coloración simple.

Para obtener mayor información sobre la morfología y composición química de las bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales
que involucran el uso de varios reactivos y éstas pueden diferenciarse con base al color que retienen. Ej. Tinción de Gram y Tinción de
Ziehl Neelsen.

PREPARACIÓN ENTRE LÁMINA Y LAMINILLA

Este tipo de preparación permite observar vivos a los microorganismos y resulta muy útil cuando se quiere determinar su motilidad.
Estas preparaciones son muy fáciles de realizar, pues sólo se coloca sobre la lámina portaobjeto la suspensión de microorganismos a
observar y luego ésta se cubre con una laminilla. Entre los principales inconvenientes que tiene esta preparación, es que al no estar los
microorganismos teñidos, se dificulta su observación al microscopio y se puede confundir el movimiento microbiano con las corrientes
internas que se producen a causa de la evaporación del medio a través del borde de la laminilla.

COLORACION SIMPLE
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Las tinciones se basan en la utilización de colorantes que pueden clasificarse como naturales o sintéticos. Los naturales se utilizan
principalmente con fines histológicos. La mayor parte de los colorantes que se utilizan para teñir bacterias son sintéticos, muchos de
ellos son las anilinas y los derivados del benceno. Se habla de coloración simple cuando una muestra extendida se tiñe con un solo
colorante. Si la preparación se tiñe con safranina, las bacterias adquirirían un color rojo, si se utiliza azul de metileno, se teñirán de
azul, si por el contrario se tiñen con cristal violeta, las bacterias aparecerán teñidas de color violeta, es decir adquirirán el color del
único colorante que se utilizó. Este procedimiento permite distinguir la morfología y estructuras internas de la célula bacteriana, como,
por ejemplo, la presencia de endospora bacteriana. Existen coloraciones especiales que permiten poner de manifiesto estructuras
bacterianas como, por ejemplo: flagelo, cápsula, endosporas, etc.

TINCION DE GRAM
En 1884, un bacteriólogo danés, Christian Gram, desarrolló una técnica de tinción que permite separar a las bacterias en dos grandes
grupos: gram positivas y gram negativas, basados en si retienen o no, el colorante primario (cristal violeta) luego del proceso de
decoloración. Los organismos que retienen el cristal violeta luego de la adición del agente decolorante, el alcohol, aparecen como azul
oscuro o violeta, y se designan como gram positivos; aquellos que pierden el cristal violeta y se tiñen con el colorante secundario, la
safranina, aparecen como rojos y se designan como gram negativos. Un examen minucioso de un extendido bacteriano teñido
diferencialmente, provee una información muy importante sobre la caracterización morfológica e identificación de la muestra. Por
ejemplo, una reacción positiva o negativa a la Tinción de Gram es sumamente importante como medio primario de clasificación. El
procedimiento puede resumirse de la siguiente manera: una vez que la preparación ha sido fijada a la lámina portaobjeto, se añade el
colorante cristal violeta, el cual se deja en contacto por 1 minuto y las células se tiñen de color violeta, posteriormente se lava el
exceso de colorante con agua destilada, luego se añade la solución de lugol, que actúa como mordiente, y se deja en contacto por un 1
minuto. El yodo se combina con el cristal violeta y forma un compuesto que precipita en el interior de la célula; este complejo puede
extraerse fácilmente con alcohol etílico de las gram negativas, pero no se remueve fácilmente de las gram positivas. Una vez realizada
la decoloración se añade el colorante de contraste, la safranina, la cual se deja en contacto por 30 segundos; el exceso de colorante se
elimina con agua destilada. Las láminas así preparadas se secan a temperatura ambiente o con la ayuda de toallas absorbentes. Este
procedimiento se esquematiza en la siguiente figura:

Ilustración de la apariencia de cocos gram positivos y de bacilos gram negativos en diferentes estadios del procedimiento de tinción de
Gram.

El por qué las bacterias gram positivas retienen el complejo cristal violeta-yodo y las gram negativas no, ha sido un tema muy
controversial. Una de las explicaciones que se dan, está relacionada con la naturaleza química de la pared celular de las bacterias gram
positivas que previenen la remoción del complejo con el alcohol. Otra teoría mantiene que la gruesa envoltura celular de las gram
positivas, específicamente la capa
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gruesa de peptidoglucano, se deshidrata y al encogerse por el efecto del alcohol, ocasiona el cierre de los poros lo cual impide la salida
del complejo cristal violeta-lugol.

En definitiva, la pared celular es la barrera para la decoloración. Si se altera la pared celular de las bacterias gram positivas se
transforman en gram negativas.

Esquema de la envoltura celular de una bacteria gram positiva

PREPARACIÓN DE LAS LÁMINAS

Para realizar una coloración, ya sea simple o diferencial, es necesario como primer paso, preparar el extendido de la muestra sobre la
lámina portaobjeto y fijarlo, para posteriormente añadir el o los colorantes y observar la muestra teñida bajo el microscopio de luz.
Preparación del extendido

1. Colocar en cada una de las láminas limpias, secas y desgrasadas, una gota de solución salina utilizando el asa de platino
previamente esterilizada.

2. Tomar asépticamente con el filamento una pequeña muestra del cultivo sólido suministrado por el profesor y mezclar con la gota
de solución salina para obtener una suspensión. También puede utilizarse un cultivo líquido, en dicho caso, la muestra se toma con el
asa de platino y no es necesario colocar la gota de solución salina.

3. Extender la suspensión con el asa de platino previamente esterilizada y enfriada.

4. Dejar secar la lámina a temperatura ambiente.

5. Fijar la muestra extendida a la lámina utilizando calor. Esto se logra pasando la lámina varias veces por la llama del mechero
(máximo 3 veces). La lámina no debe calentarse mucho y ello se verifica tocando suavemente el dorso de la mano con lámina. El
operador debe soportar el calor, sin quemarse.
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Tinción de Gram
1. Colocar las láminas extendidas y fijadas en una bandeja adecuada y cubrir su superficie con cristal violeta por un minuto. Lavar con
agua destilada y escurrir.

2. Cubrir la superficie de la lámina con la solución de lugol por un minuto. Lavar con agua destilada y escurrir.

3. Colocar cada una de las láminas en posición inclinada y decolorarlas con alcohol a 95° hasta que el color libre deje de salir
(aproximadamente 10-20 segundos). Lavar con agua destilada y escurrir. Este es el paso más importante de la coloración ya que una
excesiva adición del alcohol permite la salida del colorante primario de las células gram positivas.

4. Cubrir las láminas con safranina por 30 segundos. Lavar con agua destilada y escurrir.

5. Secar las láminas utilizando papel absorbente.

Observación bajo el microscopio de luz.

1. Colocar una gota de aceite de inmersión sobre las láminas teñidas y secas y examinarlas bajo un microscopio de luz,
utilizando el objetivo de inmersión. (90X-100X).
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2. Observar varios campos hasta encontrar aquél, donde las células están adecuadamente separadas, para permitir la visualización de
la morfología, arreglo de las células, presencia de endosporas y su reacción al Gram.

Precauciones
Para obtener una buena lámina de Gram, es necesario tomar en cuenta ciertas precauciones tanto en su preparación como en su
observación bajo el microscopio con el objetivo de inmersión.
1. Extendido: Este paso es importante ya que la preparación debe ser fina y no gruesa. Si se coloca demasiada muestra del cultivo
bacteriano, el extendido quedará muy grueso y una vez teñido, sin la ayuda del microscopio se observará una gran mancha coloreada,
pero vista bajo el microscopio, con el objetivo de inmersión, se observará una masa oscura de estructuras que no pueden ser
distinguidas en forma individualizada y el proceso de identificación de la morfología, arreglos y estructuras tipo endosporas, etc. se
dificulta.
2. Fijación: Si el extendido bacteriano no se fija adecuadamente, las células bacterianas se pierden durante el proceso de tinción que
involucra varios lavados y trae como consecuencia la ausencia de bacterias teñidas. Por el contrario, un sobrecalentamiento puede
ocasionar la aparición de artefactos y la ruptura de la morfología de las células bacterianas.
3. Antes de colocar la lámina en la platina determine en cuál lado de la lámina portaobjeto está localizado el extendido.
4. Observe varios campos hasta encontrar aquél que permita una identificación de la morfología, estructura y reacción al Gram.
Procedimiento
1. Ingrese al simulador virtual
https://learn.chm.msu.edu/vibl/vibl/GramStain/gram_stain_HTML5Canvas.html

2. Ingrese a descripción y realice la lectura que allí se describe, con base en la información diligencie la tabla #1

3. Diríjase a la parte superior izquierda e Ingrese nuevamente a menú, dele ingresar a pasos y realice la lectura y descríbalos en
la tabla # 2 del anexo
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4. Nuevamente diríjase a la parte superior derecha e ingrese a menú y seleccione la opción start y describa lo que allí sucede
(diligencie su descripción en la pregunta 3 del anexo)

5. Con ayuda del simulador, realice cada uno de los pasos descritos en la tabla #2 y complete la tabla # 3 del anexo

6. Diligenciada la tabla #3, tome una captura de la imagen y describa lo que en ella observa, para ello coloque la imagen en la
tabla #4
7. Observe el siguiente video https://www.youtube.com/watch?v=q0Y9e5JjOzc y la siguiente imagen
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Conociendo la información nuevamente diríjase al simulador y en la parte superior de la imagen y dar

clic sobre examinar ejemplos

complete la información que se le solicita en la tabla #5

8. Responda las siguientes preguntas, en que consiste

a. la Tinción de Ziehl-Neelsen
b. la Tinción negativa
c. Tinción de azul algodón de lactofenol
d. Tinción de Wright

BIBLIOGRAFÍA, WEBGRAFÍA, OTRAS FUENTES

 Simulador de tinción de gram
https://learn.chm.msu.edu/vibl/vibl/GramStain/gram_stain_HTML5Canvas.html
 Benson, Harold. 1979. Microbiological Applications. A Laboratory Manual in General Microbiology. Third
edition. Wm. C. Brown Company Publishers. Dubuque, lowa
 Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (segunda
edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela
 Pelczar and Chan. 1977. Laboratory Exercises in Microbiology. Fourth edition. Mc Graw-Hill Book Company.
 Seely. H; Van Demark, P. 1962. Microbios en acción. Manual de Laboratorio para Microbiología. Editorial
Blume. Madrid-España.
 Las tinciones básicas en el Laboratorio de Microbiología: Un enfoque gráfco
 https://www.zaragoza.unam.mx/wp-
content/Portal2015/publicaciones/libros/cbiologicas/libros/Tinciones.pdf
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Autor /Autores Fecha de actualización

Ovidio Rafael Martínez abad MAYO 15 DE 2023

ANEXOS
1. Diligenciamiento de la tabla # 1 Tabla#
1: Descripción
Objetivos La tinción de Gram es la tinción más utilizada en los laboratorios de microbiología
química, y suele ser el primer paso para identificar bacterias, además en la tinción de
gram se puede observar la morfología y configuración de la bacteria, es decir: coccus
gram-positivos en cadena coccus gram-negativo
Mecanismos En función de los diferentes componentes las bacterias retendrán o perderán la
mancha primaria cristal violeta cuando forman un complejo con el yodo tras la
decoloración con el alcohol. Luego se usa una contra-tinción (safranina) para teñir el
material que no retuvo la tinción primaria.
Componente Reactivo de tinción de gram= Cristal Violeta (tinción primaria)
Yodo
Alcohol decolorante
Safranina (fijar la muestra).

Método Se pone una suspensión de bacteria en un porta objetos de vidrio limpio, se deja secar
y después se fija con calor, luego el porta objetos se tiñe con cristal violeta, se trata
con yodo para formar un complejo con el cristal violeta en la pared celular, se decolora
con algo y luego se contra tiñe con safranina, se lava con agua y a continuación el
portaobjetos se observa bajo el microscopio utilizando los objetivos de 100X
Interpretación Morado= Gram positivo
Rosa= Gram negativo

2. Diligenciamiento de la tabla #2

1 Calentar el porta objetos: Click en el mechero de Bunsen, pasar el porta objetos suavemente dos o
tres veces (1-2 segundos) a través de la llama, esto provocara la distorsión de las células.
2 Agregar el cristal violeta y esperar 1 minuto
3 Lavar con Agua
4 Agregar Yodo y se deja actuar por 1 minuto
5 Se lava con agua
6 Se agrega alcohol y se deja actuar entre 5-10 segundos
7 Se lava con agua
8 Se agrega la safranina y se deja actuar por 1 minuto
9 Se lava nuevamente con agua
10 Se ve bajo el microscopio

3. Descripción de los primeros procesos del simulador

1. Se toma el azaro, se calienta

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2 . Se lleva al tubo de ensayo, se toma la muestra y se pone

en el porta objetos de vidrío

3 . Se vuelve a esterilizar el azaro y se deja reposar por 5

minutos la muestra que se puso previamente en el porta
objetos de vidrio

4. Diligenciamiento de la tabla # 3. descripción de pasos

Paso Descripción del paso realizado Imagen del paso realizado

Calentar el porta objetos: Click en el mechero de Bunsen, pasar el porta objetos

1 suavemente dos o tres veces (1-2 segundos) a través de la llama, esto provocara
la distorsión de las células.

2 Agregar el cristal violeta y esperar 1 minuto

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Lavar con Agua

3

Agregar Yodo y se deja actuar por 1 minuto

4

Lavar con Agua

5

Se agrega alcohol y se deja actuar entre 5-10 segundos

6

Lavar con Agua

7

8
Se agrega la safranina y se deja actuar por 1 minuto
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9 Lavar con Agua 9

10
Se ve bajo el microscopio

6. Diligenciamiento de tabla # 5
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Imag Imagen Nombre Tipo de Forma Reacció 9
en selecciona de la bacterias de la n al
# da bacteria presente bacteria GRAM
s
1
STAPHYLOCOCC STAPHYLOCOCC ESTAFILOCOCO
US AEREUS US ESFERAS COCOS

2
ESTREPTOCOCO ESTREPTOCOCO ESTREPTOCOCO
PYOGINES PYOGINES S

ESTREPTOCOCO ESTREPTOCOCO ESTREPTOCOCO

NEUMOCOSOS NEUMOCOSOS NEUMOCOSOS

4
CORINEBACTERI CORINEBACTERI MYCOBACTERIU
A DIPHTERIANA A DIPHTERIANA M
TUBERCULOSIS

5
BACILLUS BACILLUS MYCOBACTERIU
ANTHRACIS ANTHRACIS M
TUBERCULOSIS

6
NEISSERIA NEISSERIA ESTAFILOCOCO
GONORRHOEAE GONORRHOEAE S

7
HAEMOPHILUS HAEMOPHILUS MYCOBACTERIU
INFLUENZAE INFLUENZAE M
TUBERCULOSIS

6. Responda las siguientes preguntas, en que consiste

a. La Tinción de Ziehl-Neelsen
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La tinción de Ziehl-Neelsen es la técnica comúnmente usada en el diagnóstico rutinario de tuberculosis. Es una técnica rápida,
fácil y de bajo costo,24 lo que permite que se pueda realizar en casi cualquier laboratorio clínico. Esta tinción permite
diferenciar a las bacterias en dos grupos: aquellos que son capaces de resistir la decoloración con alcohol-ácido y aquellos que
no lo son.2

b. La Tinción negativa

La tinción negativa fue desarrollada originalmente para microscopia de luz con el fin de rodear y delinear las bacterias no
teñidas u otros materiales biológicos. Este método es muy útil, aunque está limitado por la presencia de un fondo oscuro que
no permitirá la correcta identificación de forma nítida y detallada de los componentes de dichas estructuras. En microbiología,
la tinción negativa proporciona un resultado presuntivo de la presencia de Cryptococcus neoformans, microorganismo
causante de meningitis en pacientes con inmunosupresión, siendo la técnica más utilizada para poner de manifiesto su cápsula.

c. Tinción de azul algodón de lactofenol

El examen microscópico es de gran importancia en micología para la observación de las diferentes especies de hongos de
interés clínico. Se deben utilizar tinciones que logren preservar la integridad de las estructuras fúngicas.18 Para la correcta
identificación de hongos de interés clínico, ya sea con fines de diagnóstico o estudios taxonómicos, es necesario observar las
estructuras fúngicas con una alta calidad y contraste; para ello se utilizan diversos compuestos químicos que permitan la
tinción entre la pared y el citoplasma de las células fúngicas.

d. Tinción de Wright

La tinción de Wright es una técnica que se emplea generalmente para la diferenciación de elementos celulares de la sangre y es
clasificada como una tinción poli cromática, dado que puede teñir compuestos ácidos o básicos presentes en una célula. Esta
tinción tiene diversos usos en microbiología; en la parasitología, se le emplea en la búsqueda de hematozoarios como
Plasmodium spp. El reactivo de Wright está compuesto por eosina y azul de metileno, cuando éste se oxida se conoce como
azur B a una concentración de 0.8 g/L empleando como solvente alcohol metílico.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
5. Colocación de la imagen de la tabla #4
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