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Definición:

Las técnicas histopatológicas comprenden la preparación adecuada de los tejidos, para su estudio
microscópico, lo cual se logra básicamente mediante una serie de procedimientos que consisten
en: a) Fijación b)Deshidratación c)Aclaramiento d)Inclusión e)Corte f)Tinción

FIJACIÓN:

Tiene por objeto evitar en el tejido, los efectos de la autolisis post-mortem en el caso de las
autopsias, y en el caso de las biopsias, la descomposición que sufre el tejido al privársele de
irrigación sanguínea. Otra de las ventajas del proceso de fijación, es que los elementos
constitutivos de las células, pueden resistir el tratamiento sucesivo con varios reactivos sin pérdida
o distorsión importante; también aumenta la consistencia del tejido permitiendo un mejor corte
de este. Algunos fijadores por ejemplo los mercuriales, actúan también como mordiente para los
colorantes.

La cantidad de líquido fijador, debe será aproximadamente de 15 a 20 veces el volumen de la

muestra. Los fragmentos de los órganos tomados al momento de verificar la autopsia, o de las
biopsias recibidas, no deben ser mayores de 5 mm. De espesor y deben ser tomadas en ángulo
recto a la superficie de los órganos y ser lo suficientemente profundos para comprender los
constituyentes anatómicos normales, tales como: Capsula, Corteza, Pirámide y Pelvis (en el caso
de un riñón).

Los fijadores más usados en el departamento de Patología son: Formalina al 10%, Solución de
Zenker y Líquido de Bouin.

*Formalina al 10%*

Ventajas:

1. Es el fijador más barato que existe por lo tanto es de elección para los trabajos de rutina en
Anatomía patológica.

2. Es un buen fijador único que determina una moderada conversión de la estructura tisular.

3. Por ser buen desinfectante y no endurecer excesivamente los tejidos, es un medio óptimo para
fijar y almacenar biopsias y piezas quirúrgicas.

4. Provoca escasa retracción tisular.

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5. Tiene aproximadamente una velocidad de un milímetro por hora apenas altera la coloración
tisular, por eso es el agente de elección para fijar grandes piezas quirúrgicas.

6. Es excelente fijador para el tejido adiposo y para lípidos en general y se emplea como agente
de elección para fijar el tejido nervioso.

7. El proceso de fijación puede ser acelerado o retrasado sin graves inconvenientes modificando la
temperatura, así a temperatura ambiente se consigue una fijación completa a partir de las 36
horas. A 35º entre 12 y 24 horas y a 55ºC en solo 3 horas.; por este motivo la formalina es un
fijador de elección cuando se emplean hornos de microondas en técnicas de histotecnología.

8. Es compatible con la mayor parte de las tinciones que se utilizan rutinariamente en Anatomía
patológica.

Desventajas:

1. Si se emplean soluciones no amortiguadas, tiende a reducir la tinción basófilo, y si la fijación se

prolonga por más de 24 horas e inclusive varios días, tiende a disminuir la coloración acidofila.

2. Por acción de la luz y del oxígeno atmosférico se transforma progresivamente en ácido fórmico,
y ésta sustancia tiene la propiedad de disolver rápidamente la cromatina nuclear por eso con el
paso del tiempo los núcleos celulares adoptan un aspecto fantasma, para evitar este
inconveniente el formol debe guardarse en frascos opacos.

3. Tras la utilización prolongada de formalina, debido a que se convierte en ácido fórmico, esto

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confiere a las piezas un tinte grisáceo, y en tejidos que tienen mucha sangre da origen a un
pigmento formólico que es negro o pardo oscuro que precipita en aglomeraciones irregulares
sobre estructuras preexistentes.

*Solución de Zenker*

Ventajas:

-Permite una mejor tinción de los núcleos y de los tejidos conectivos.

Desventajas:

-Causa una lisis eritrocitaria considerable.

-Cuando la penetración va más allá de 2-3 mm., se vuelve lenta.

-Si los tejidos se dejan en este fijador, por más de 1 día, se vuelven duros y quebradizos.

*Liquido de Bouin*

Ventajas:

-Es uno de los mejores fijadores para la demostración de Glucógeno.

-Penetra rápidamente, y es un buen fijador para la mayoría de los casos, pero no se recomienda
para riñón, ni para el estudio de mitocondrias ya que se fijan deficientemente.

Desventajas:

-Provoca lisis eritrocitaria, por lo que los tejidos no deben dejarse por más de 24 horas, ya que se
endurecen y se hacen quebradizos, lo cual dificulta posteriormente su corte.

DESHIDRATACIÓN:

Los tejidos tienen grandes cantidades de agua, tanto extracelular como intracelular, la cual debe
ser eliminada y reemplazada por parafina; para lograr este proceso, se debe utilizar alguna
sustancia que se mezcle con agua y posea afinidad con ella, de manera que pueda penetrar
fácilmente, a través de las células, dicha sustancia será posteriormente sustituida por otra en la
cual sea soluble la parafina. Es necesario realizar este procedimiento en dos pasos; se usa como
agente deshidratante el alcohol etílico (prácticamente el mejor agente deshidratante), debido a
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que la parafina es insoluble en alcohol, se deberá luego sustituir este por Xilol. Este último
procedimiento se denomina Aclaramiento o Desalcoholización.

Diremos entonces que el Aclaramiento o Desalcoholización, permite que el alcohol introducido en

los tejidos, sea reemplazado por un líquido que disuelve la parafina, con la cual el tejido
posteriormente va a ser impregnado. La palabra Aclarar proviene de que, además de eliminar el
alcohol, muchas de estas sustancias tienen la propiedad de volver transparentes los tejidos, pues
el índice de refracción de los agentes aclarantes es aproximadamente igual al de ellos.

El Xilol, es un excelente y verdadero agente aclarante, pero tiende a hacer que los tejidos sean
excesivamente duros y quebradizos, por dicho motivo, nunca deben de dejarse en esta sustancia
los tejidos, por más de 3 horas, o de lo contrario hará muy difícil la realización de los cortes.

Respecto a la Deshidratación, se puede decir que debe ser lenta, para evitar la contracción brusca
del tejido, lo cual produciría de las estructuras tisulares. Con este objetivo el tejido se sumerge
sucesivamente en alcoholes de concentración ascendente, iniciando con alcohol al 50 %, luego con
una solución de 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 %
para eliminar el agua. Esto se hace porque si se colocara el tejido en una solución al 100% de
alcohol, inmediatamente el agua saldría muy rápido del tejido y se deformaría, en este caso el
alcohol de 100° es metílico y el resto son etílicos.

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INCLUSIÓN:

Este proceso comprende la impregnación de los tejidos con un medio que llene todas las
cavidades naturales, espacios e intersticios tisulares y aun los espacios intracelulares, a fin de
proporcionar una consistencia firme al tejido, la que es necesaria para hacer cortes lo
suficientemente delgados sin provocar distorsión.

En nuestro caso, acá en el departamento, la inclusión se hace en parafina, por ser el método más
simple; la parafina debe mantenerse fundida a una temperatura de 56-58°C.
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Penetración de Parafina a 56-58°C.

AUTOTECHNICON

Formación de Bloques de Parafina

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Los pasos de deshidratación, desalcoholización e inclusión en parafina se verifican mediante el uso

de un aparato denominado Autotechnicon (marca de fábrica), el cual además de introducir
automáticamente los tejidos en las soluciones, está provisto de un rotor, el que acelera la
deshidratación y el Aclaramiento. Estos pasos también pueden verificarse a mano, contando con
estufas de regulación automática que mantengan constante la temperatura de fusión de la
parafina.

TINCIÓN:

Las muestras de tejidos, se incluyen dentro de pequeños bloques de parafina, para poder ser
sujetados en el micrótomo, y posteriormente practicar los cortes histológicos.

Realización de los cortes en Micrótomo tipo Minot

Una vez hechos los cortes, se extienden en un baño de agua a 56° C, y se montan sobre
laminas a las que previamente se les ha cubierto de una mezcla de albumina de huevo y
glicerina; ello es con el objeto de lograr una mejor fijación del tejido a la lamina. Para poder
colorear los cortes ya montados, es necesario sustituir la parafina por agua. Con este objeto se
procesan los cortes sumergiéndolos primero en baños de Xilol para quitar la parafina y,
posteriormente rehidratandolos en baños de alcoholes de concentración decreciente,
sumergiéndolos finalmente en agua. Una vez rehidratado el tejido, se procede a la coloración
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con Hematoxilina-Eosina que es la más usada.

La Hematoxilina se emplea para la tinción Basofila, se elimina el exceso de colorante con una
solución de alcohol y acido clorhídrico y se procede a la técnica de azulamiento mediante el
uso de Borato de Sodio. Como colorante para la tinción Acidofila, se usa la Eosina. Una vez
coloreada la lámina, es preciso deshidratar el tejido con el objeto de poder cubrir el corte con
bálsamo del Canadá y una laminilla, con el fin de preservarlo ya coloreado en forma indefinida.

Para la deshidratación se usan nuevamente alcoholes en concentraciones ascendentes y

posteriormente, para la eliminación de este, se emplean baños de Xilol.

Batería de coloración de Hematoxilina-Eosina

El Bálsamo del Canadá es insoluble en agua, pero es soluble en Xilol. Posteriormente se agrega
Bálsamo del Canadá, y se cubre la preparación con la laminilla.

De todo lo anteriormente expresado, se deduce que la mayor responsabilidad del prosector,

en cuanto a la preparación de láminas, es proporcionar una adecuada fijación a los tejidos.

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En resumen, los puntos más importantes que el prosector deberá tomar en cuenta son:

1. Practicar la autopsia con el menor número de horas post-mortem en cuanto sea posible.
2. Tomar muestras de un tamaño adecuado (0.3-0.5 cm de espesor, 3x3 cm).
3. La concentración de la formalina deberá ser al 10%, y esta de preferencia debe ser
alcalina.
4. La cantidad de formalina deberá ser de 15 a 20 veces del volumen de la muestra a fijar.
5. El tiempo de fijación generalmente no deberá exceder las 24 horas, con el fin de obtener
una coloración adecuada con un buen contraste.
6. Al momento de tallar los especímenes quirúrgicos, deberá dar a los cortes las dimensiones
adecuadas con un grosor que no exceda los 3 mm. Y 2x3 cms de ancho y largo
respectivamente.
7. Los cortes de medula ósea y hueso en general, deberán someterse primero al proceso de
fijación y posteriormente a la decalcificacion con Acido Nítrico, el cual tendrá una
concentración del 5%, y deberá ser cambiado cada 24 horas, hasta que las muestras
puedan ser cortadas con una hoja de bisturí.
8. Deberá tener un cuidado especial en controlar, las concentraciones de los líquidos usados
en el Autotechnicon, lo mismo que asegurarse que los tiempos en cada una de las
soluciones sean los correctos.
9. La Temperatura de la Parafina para la inclusión, no deberá exceder los 56-58°C, a fin de
conservar adecuadamente la arquitectura tisular.

Las sustancias usadas en el Autotechnicon son las siguientes:

*Alcohol a 70°

*Alcohol a 80°

*Alcohol a 90°

*Alcohol a 100° (2)

*Xilol puro (4 recipientes)

*2 baños de parafina a 56-58°C.

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Técnicas Especiales de Coloración

I. Investigación de las grasas: Las grasas neutras son solubles en ciertos solventes tales
como el Xilol y el Alcohol, por lo tanto no es posible encontrarlos en los cortes
habituales en parafina; el procedimiento a usarse será el de practicar un corte por
congelación del tejido en estudio, el que posteriormente se tratara con colorantes que
son solubles en las grasas: El Rojo O de Aceite, el Sudan II, III, y IV.

Las gotas lipidicas aparecen en Rojo (cultivo celular de

bazo de trucha).

II. Investigación de Fibras Elásticas: Para colorear las fibras elásticas, se usa el método
de Verhoeff (es un método que utiliza como colorantes Cloruro Férrico, Hematoxilina y
Yodo; las fibras elásticas tiñen en negro, el colágeno en rojo, el musculo y el epitelio
queratinizado en amarillo, los
III. núcleos en azul o negro).
IV. Investigación de Glucógeno: La fijación del tejido para investigar glucógeno, puede
hacerse con formalina neutra al 10%, pero el fijador de Bouin es el que mejores
resultados da al respecto. La coloración del glucógeno es posible por el método del
yodo, pero este no es específico. De preferencia se hará por el método de Best con
Carmín, el cual es una tinción muy selectiva del glucógeno y constituye una de las
mejores técnicas. Con este método el glucógeno toma un color rojo brillante.
V. También podrá usarse la coloración de PAS con digestión diastasica; la diastasa que
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se usa es la Amilasa, la que digiere el glucógeno y no las mucinas; es decir, que con ella
pueden diferenciarse las dos sustancias.

VI. Investigación de Retículo: Se usa la coloración argentica.

VII. Visión general: a pequeños aumentos se observa el armazón de soporte de los

cordones hepatocitarios y del sistema vascular y biliar, que se constituye a expensas
de una red tridimensional de fibras de colágena tipo III o reticulina. Las fibras de
reticulina rodean una figura hexagonal conocida como lobulillo clásico. Desde la
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periferia de este lobulillo clásico se dirigen hacia el centro, rodeando a las láminas de
hepatocitos. También se encuentran rodeando a la vena centro-lobulillar en el centro
del lobulillo y al espacio porta, en los ángulos del lobulillo clásico, donde se ubica una
rama de la arteria hepática, una rama de la vena porta y un conducto biliar.

Visión específica: se dibuja una malla fina de color negruzco que bordea los cordones
hepatocitarios (los núcleos de los hepatocitos se han marcado inespecíficamente de
oscuro), separándolos del endotelio de los sinusoides, que radialmente se dirigen
desde los tabique periféricos del lobulillo hasta la vena centrolobulillar. Igualmente
evidenciamos el refuerzo del espacio porta alrededor de tres estructuras huecas, que
corresponderán cuando las visualicemos con una técnica tinto rial estándar al
compartimiento vásculo-biliar.

VIII. Investigación de Mucinas: Para la tinción de las mucinas del tejido conjuntivo
(Sustancia Intersticial) podrá usarse la técnica de PAS, que permite teñir mejor
aquellos azucares polimerizados que se encuentran unidos a las proteínas, es decir las
glucoproteínas; probablemente por esta razón se tiñen intensamente las membranas
basales. El PAS también puede usarse para la tinción de hongos.

Caso de Micetoma. Tinción de PAS

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Tinción para Mucina Observe

las células metaplasicas en
forma de copa

LA MUCINA es el término tradicional utilizado paraun grupo de macromoleculas que contiene

un grupo ácido , que se divide en dos catergorias principales : Las epiteliales o glicoproteina
compuesto de un nucleo de proteina y el acido sialico que contiene restos de carbohidratos y los
glicosaminoglicanos , del estroma que contienen acido hialuronico y que tambien puede se
sulfatado
Varias tinciones disponibles para demostracion especifica de mucinas , altamente ácidas.Estos
incluyen el azul de Alciano , hierro coloidal de hierro de lata diamina y el clasico musicarmin
Mayer.
Se utiliza para clasificar a la metaplasia gástrica, incompleta en subtipos <(que contiene
sialomucina y sulfomucina )que contiene un potencial maligno supuestamente.

IX. Investigación de Tejido Colágeno: La tinción del colágeno podrá hacerse por el
método de Van Gieson, con el cual el colágeno toma un color rojo brillante; los otros
tejidos se teñirán de amarillo y los núcleos de azul negro. También puede usarse el
Tricromico de Masson con el cual el musculo, citoplasma y queratina se ven rojos, y el
colágeno como azul o verde, según sea el colorante de contraste.

Las células musculares de color

rojo muestran disposición
espira lada.
El colágeno de color verde
Tricromico de Masson

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Corte histológico de
Bronquio secundario de
avestruz.
Método de Van Gieson
El colágeno se vuelve rojo
El musculo de color
amarillo y los núcleos
oscuros

X. Investigación de microorganismos: Podrá emplearse la coloración de Brown y Bren

para la tinción de bacterias Gram positivas (tomaran un color violeta oscuro o azul
negro) y gramnegativos (tomaran un color rojo brillante).

Biopsia transbronquial teñida con técnica de Brown-

Brenn, en el cual se observan bacterias filamentosas Gram
positivas.

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XI. Para la coloración de Bacilos Acido Resistentes, se utiliza la técnica de Ziehl Neelsen,
en la cual, los Bacilo Acido Resistentes, toman un color rojo brillante y el tejido de
fondo, de color azul; el material caseoso toma un color azul grisáceo muy claro.

Coloración de Ziehl Neelsen

XII. Para la investigación de Espiroquetas, se emplea el método de Levaditi, en el cual las

Espiroquetas se observan de color negro y el fondo pardo amarillento. El tejido en
estudio debe entregarse a la sección técnica solamente fijado, es decir, que no debe
estar procesado previamente por el Autotechnicon.

XIII. Para la tinción de Amibas: Podrá utilizarse el método de Hematoxilina Férrica.

XIV. Para la tinción de Hongos: Podrá utilizarse el método de la tinción de Gridley, en el
cual el micelio se observará de color azul oscuro, los Conidios de color rosado o
purpura y el fondo color amarillo.
XV.
XVI. RESUMEN

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Cada Tinción muestra el

color que origina
ejemplo observe la
eosina muestra el color
rojo en colágeno y la
hematoxilina azul los
núcleos
El colorante Wright :
eritrocitos y gránulos de
eosinofilos rojos.
Tricromico de Masson
musculo queratina y
citoplasma rojo

Bibliografía:

*Lynch M., Raphael S., Mellor L., Spare P., Inwood M. Métodos de laboratorio. 2da. Ed.
Interamericana. México. 1972.

*GARCÍA DEL MORAL, Raimundo; “LABORATORIO DE ANATOMÍA PATOLÓGICA”; Primera Edición;

Editorial McGraw-Hill; España; 1993.

*www.facmed.unam.mx/deptos/biocetis/.../3_tecnica_histologica.pdf

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