Histotecnia

Estudiantes: Daniela Cordero 96080618392 Carlos Ivn Perea 96040604100 lvaro Landazbal 95072014325

Docente: Emoelio

Asignatura: Histologa

Medicina Universidad de Pamplona Semestre 2-2013

HISTOTECNIA Es la ciencia que estudia los fundamentos tcnicos y la secuencia de manipulaciones necesarias para llevar a cabo el anlisis de los tejidos de los seres vivos, la reparacin de tejidos para su observacin microscpica, en toda muestra obtenida de un individuo o animal sano con la finalidad de investigar su estructura y composicin normales. Se realiza habitualmente a partir de cadveres. Se denomina tcnica histolgica al conjunto de operaciones a que se somete una materia organizada (tejido biolgico), a fin de que sea posible su estudio por medio del microscopio, posibilitando la observacin de estructuras no visibles al ojo humano.

La muestra puede ser de 2 cm de largo y 0,5 de ancho ; (por biopsia o necropsia).

Fijacin: En este paso el tejido obtenido se coloca en una sustancia fijadora para evitar los cambios despus de la muerte. Uno de los fijadores ms usado es el formol al 10% (formaldehido).

Clasificacin de los fijadores: Fijadores qumicos: son los ms empleados y pueden ser: 1. simples: constituido por una sola sustancia. 2. compuestos o mezclas fijadoras: constituidas por varias sustancias. Inclusin en parafina: Para la obtencin de cortes finos es un requisito indispensable que el tejido haya sido previamente endurecido: hasta un cierto punto, cuanto mayor sea la firmeza del tejido, tanto ms delgada resulta el corte histolgico. Con el fin de endurecer los tejidos, existen dos mtodos principales: la congelacin o la inclusin. Para las tcnicas ms frecuentes se emplea el mtodo de inclusin. El procedimiento es lento pero los preparados son de gran calidad. El tejido se impregna en un material que le confiere una consistencia adecuada para el corte. Para los cortes que deben observarse con el microscopio ptico se usa casi exclusivamente la parafina. Dado que sta es una sustancia hidrofbica los tejidos fijados se deshidratan en Alcoholes de concentracin creciente pasndolos despus por solventes intermediarios como el xileno, el benceno o el tolueno (conocidos como agentes aclarantes), y luego son colocados en una estufa con parafina fundida entre 56 y 60 C, dado que esta es slida a temperatura ambiente. Luego de impregnar al tejido, se deja solidificar a la parafina con el tejido incluido, constituyendo los bloques o tacos histolgicos. En ocasiones el tejido se impregna con acrlicos de bajo peso molecular como el metilmetacrilato, lo que permite obtener cortes ms delgados, procedimiento conocido como microscopa ptica de alta resolucin. Para microscopa electrnica se incluye casi invariablemente en resinas epoxi, y los bloques resultantes, de gran dureza, son seccionados por la navaja de diamante o de vidrio del ultra micrtomo.

Importancia del lavado de la muestra: Al concluir la fijacin, el fijador debe ser eliminado de las muestras. Para tal fin se procede al lavado de los tejidos mediante agua o alcohol. Se evita, as, que los tejidos se endurezcan demasiado o que ciertos componentes del fijador introduzcan modificaciones en los tejidos e impidan una adecuada obtencin de secciones delgadas o la coloracin correcta de sus componentes celulares. Ingredientes de los Fijadores Estos pueden ser de dos tipos: a) LIQUIDOS Son usados solos o combinados con otros lquidos o slidos, entre estos tenemos: > El cido Tricloroactico > El Alcohol Absoluto > La Acetona Fra > La Formalina La Formalina neutra al 10 % es considerada como el mejor fijador para especmenes patolgicos ya que preserva el nmero ms grande de estructuras, en un perodo de fijacin relativamente corto y con una penetracin rpida. b) SOLIDOS Se combinan con otros slidos y con lquidos para mejorar as la fijacin, encontramos: > El Cloruro Mercrico > El Dicromato de Potasio > El cido Crmico

Deshidratacin: Suena incoherente que se deba lavar el tejido y despus deshidratarlo. El exceso de fijador al momento de la infiltracin, incluso en la microtoma, podra afectar los cortes histolgicos, y por ello se debe lavar. La deshidratacin se hace empleando diferentes soluciones de alcohol de concentracin creciente.

Significa extraer o remover el agua de los tejidos fijados. La deshidratacin debe ser completa porque, de lo contrario, el solvente no acta de forma adecuada y el bloque de inclusin no alcanza la dureza requerida. Para tal fin se utilizan lquidos deshidratadores en los cuales se sumergen los tejidos, realizada por medio de alcoholes ascendente: 65%,75%,85%,95% durante 3 horas y el alcohol absoluto hasta el da siguiente. Los deshidratadores ms usados son el alcohol etlico, el alcohol isoproplico, el dioxano y el cloroformo. El uso de alcoholes graduados que vayan de la concentracin ms baja hasta la ms alta es de rutina. En el caso de la inclusin en parafina, las muestras se deshidratan en aos sucesivos en soluciones de concentracin crecientes de alcohol etlico. La deshidratacin incompleta de los tejidos se comprueba cuando stos al sumergirse en el lquido diafanizado muestran un aspecto turbio blanquecino. Con alcoholes etlicos ascendentes al: 70% 1 hora y 30 minutos 80% 1 hora y 30 minutos 90% 1 hora y 30 minutos 95% 1 hora y 30 minutos 99% 2 horas 99% 2 horas y 30 minutos

Aclaramiento o diafanizacin: Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solucin de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusin a utilizar (en la mayora de los casos se utiliza como medio de inclusin Parafina lquida). La sustancia comnmente utilizada es el Xileno o Xilol. De la misma manera se coloca la muestra de tejido en un recipiente de Xilol, el Xilol solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su ndice de refraccin. Tambin se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios de aclaramiento.

Impregnacin: En este paso la muestra se coloca en parafina lquida, cabe mencionar que se debe usar parafina histolgica. Como se ha dicho en el paso anterior el tejido est completamente lleno de xilol, ahora debido a smosis sale el xilol y entra la parafina. Durante la infiltracin rutinaria en parafina, nuestros laboratorios usan una gran variedad de las parafinas que se pueden hallar en el mercado. La deshidratacin, aclaramiento e infiltracin pueden ser realizadas manualmente pero hoy en da se realizan de modo automtico en mquinas especficas. Se realiza con parafina fundida de 58 a 62 grados C, dependiendo de la pureza de la parafina. Tiempo 2 horas y 30 minutos. Debido a osmosis se extrae el xilol y se mete la parafina entre los espacios de la muestras.

Inclusin: Aqu se forman bloques de parafina dentro de los cuales estn las muestras a estudiar. Tambin hay maquinas especializadas para la inclusin en parafina de tejidos. Despus de su inclusin y posterior secado, estos se deben poner a enfriar en un congelador para su posterior corte. - se realiza con 2 barras de leukart que son en forma de L casetes de inclusin ( base y canastilla). - se logra al infiltrar la parafina liquida al tejido, y esto disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. - se le agrega parafina fundida a 60 grados C. - facilita la seccin del tejido, a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de luz y ser observado en el microscopio.

Corte - se realiza con un micrtomo rotatorio tipo minot, donde hay que girar una palanca para realizar los cortes - se usa en muestras pequeas - realiza cortes de 5 a 8 micras

Pesca - se realiza bao de flotacin o bao de maria en forma circular a 45 grados c. para que la parafina se estire. - su fin es expandir los cortes, que quede plano. - despus se usa el porta objetos y se toma la muestra

Pegado de la muestra - se realiza en un horno a 62 grados C durante 15 minutos. - su funcin es adherir la muestra por efectos del calor al vidrio.

Coloracin - se coloca en xilol dos veces durante 3 minutos en cada uno. - El xiloldesparafina la muestra por ser disolvente. - se rehidrata la muestra en alcohol descendente al: 90% 3 minutos 70% 3 minutos 80% 3 minutos Con hematoxilina de harrys, entre 4 a 5 minutos se deja, para colorear el ncleo el cual adquiere un color de azul o violeta. Es un colorante natural basofilico con afinidad hacia la parte acida, en este caso el ncleo. Es un colorante indirecto ya que necesita de otro reactivo para su coloracin. - posteriormente se lava con agua del grifo. - con alcohol acido al 1% se ayuda a fijar el alcohol al nucleo. - se lava nuevamente. - se aade agua alcalina (carbonato de litio) para diferenciar el color. - se lava. - con eosina nos colorea de rosado o rojo.

Este es (eosina) un colorante artificial acidofilo (afinidad por parte basical) por lo que se adhiere a la membrana y al citoplasma. Es directo -Lavamos y dejamos secar.

Sellado - se puede realizar con entellan y es rpido, de un da para otro. - tambin con blsamo de canada, pero con l hay que esperar 3 meses

Micrtomos Los micrtomos son instrumentos de corte para la elaboracin de preparados, se usan en la microscopa los cuales permiten realizar cortes extremadamente finos, su inicio viene por la utilizacin de los microscopios de luz, los cuales requeran que las muestras fueran lo suficientemente finos para que la luz los traspasara; normalmente los micrtomos modernos permiten cortes de un espesor desde 0,1 hasta 100 m. Los micrtomos utilizan cuchillas de acero, vidrio o diamante, dependiendo del tipo de muestra que se est cortado en lonjas y del grosor deseado de las secciones del corte. > Micrtomo de Minot o Rotatorio: El nombre del micrtomo de rotacin se da porque el sujeta-muestras es accionado mediante un volante. Estos micrtomos, tambin disponen de una cuchilla fija y un sujeta-muestras mvil, el movimiento de rotacin del volante se transforma en un movimiento recto. Normalmente el sujeta-muestras de estos micrtomos se mueve en direccin hacia abajo. Las muestras preparadas se acumulan sobre la cuchilla. La ventaja de estos micrtomos es que la alta masa del volante iguala las diferentes durezas en la misma prueba, lo que resulta en un corte uniforme de 3-15 m. > Ultra micrtomo: Presenta cortes semifinos (1-3 m) y ultrafinos (50-100 nm). La confeccin de cortes semifinos, y sobre todo de cortes ultrafinos, requiere una gran preparacin tcnica, experiencia y habilidad. Alrededor de las cuchillas se fabrica un alza con agua en la que flotan los cortes, los cortes ultrafinos se recogen en una rejilla y los semifinos se recogen con un pincel fino para armar la muestra. > Criostato: Presenta cortes de 10 -30 m. Los cortes de criostato pueden utilizarse para la mayor parte de tcnicas de tincin rutinarias y son especialmente tiles para desarrollar tcnicas histoqumicas e inmunocitoqumicas. Son tiles tambin para la demostracin de sustancias solubles que no resisten el proceso de deshidratacin como son los lpidos. La obtencin de cortes con el criostato es una tcnica rpida, utilizada cuando se precisa estudiar una biopsia y dar un diagnstico rpido.

> Vibrtomo: Permite realizar Cortes gruesos (30- 100 m); una de las ventajas de obtener cortes vibratmicos es que el tejido permanece durante todo el proceso en un medio acuoso, sin sufrir deshidratacin alguna, lo cual preserva de forma ptima las actividades enzimticas y las caractersticas antignicas. La obtencin de cortes vibratmicos es relativamente sencilla, pero es un proceso lento. > Micrtomo de mano: El rango de corte es de 20-120 m. Consta de un tornillo de paso de rosca fino, que permite elevar el material a cortar sobre una plataforma que no envuelve. Para realizar el corte se desliza una cuchilla de barbero que secciona la porcin de la muestra que sobresale de la superficie. > Micrtomo de avance de la cuchilla: Posee una estructura mecnica interna lo que les proporciona una gran estabilidad, asegurando cortes reproducibles y uniformes, el retroceso de la cuchilla se realiza de forma rpida y sencilla. > Micrtomo Ttrander: Es un tipo de micrtomo Reichert-Jung especfico que se utiliza para obtener secciones macro o microscpicas de rganos completos. > Micrtomo de Oscilacin, Balanceo o de Cuchilla Vibrante: Actualmente se utiliza para el control de calidad de materiales en industria y en determinados tipos de estudios histolgicos. Es un equipo ideal para aplicaciones de alta precisin en neurofisiologa, neuropatologa y patologa experimental. Posee un mecanismo de avance de tornillo y las secciones se obtienen por un sistema oscilatorio de palanca lo cual no permite obtener seriadas.

Colorantes y su fundamento de accin Clasificacin de colorantes segn su origen: 1. Colorantes naturales: - Hematoxilina: se obtiene una tincin azul y acta en el ncleo, regiones acidas del citoplasma, matriz del cartlago. - Colorante de orcena para fibras elsticas: Se obtiene un color pardo y acta en fibras elsticas. - Colorantes de Wright y Giemsa: Se obtiene colores como rosa, purpura y azul, se utiliza para tinciones diferenciales de clulas hemticas . - Tinciones argenticas: Se obtiene un color negro y acta en fibras reticulares - Hematoxilina ferrica: Se obtiene un color negro y acta en estriaciones de musculo y ncleos de eritrocitos 2. Colorantes artificiales o sintticos: A. cidos: Un ejemplo claro es la eosina, colorante cargado en forma negativa, el cual se une a componentes celulares cargados positivamente. Estos componentes cargados positivamente se denominan acidfilos, porque tienen afinidad por los colorantes cidos, estos colorantes se unen a grupos aminos de las protenas. Estas protenas pueden pertenecer al citoesqueleto de la clula o hallarse en la

matriz extracelular. Debido al elevado contenido de protenas del citoplasma la eosina es un excelente colorante citoplasmtico. B. Bases: Un ejemplo es el azul de metileno, colorante cargado positivamente, se une a componentes celulares cargados negativamente. Estos componentes cargados negativamente se denominan basfilos, porque tienen afinidad por los colorantes bsicos. Por ejemplo, estos colorantes se unen al ncleo y ciertas regiones del citoplasma. C. Neutros: En este grupo se puede incluir el eosinato son colorantes en los que la porcin cida y la bsica colorean. Tien las partes bsicas de una clula de un color y las partes cidas de otro. Tien el ncleo de un color y el citoplasma de otro. D. Indiferentes: tien aquellas estructuras o sustancias que los disuelven ms fcilmente que el lquido en que estn preparados. Un ejemplo es el colorante sudan, un colorante de lpidos.

Pasos para realizar una coloracin * Desparafinizacin: Se realiza en tolueno o xileno durante 2 minutos * Deshidratacin: Se realiza con alcoholes descendentes * Hidratacin: Se realiza agua destilada * Rehidratacin: 90, 80, 70% durante 3 minutos * Coloracin: Hematoxilina de Harrys: colorante basfilo, parte cida (ncleo): azul a violeta. Es indirecto, necesita de otros reactivos durante 3 minutos. * Lavar con agua: Alcohol cido (ayudar a fijar color al ncleo). * Lavar agua alcalina (carbonato de litio) para diferenciacin del color.

* Lavar eosina (colorante artificial acidfilo) parte bsica citoplasma y membrana).

* Secar en horno.

Tipos de Coloracin Tincin Eosina: Tipo: cida / Basoflica Caractersticas: Tie protenas y estructuras con afinidad por los cidos en diferentes tonos de rojo Se usa: Tincin histolgica general. Tincin Hematoxilina Tipo: Bsica - Acidoflica. Caractersticas: Tie de color azul ncleos, cidos nuclecos y estructuras basoflicas (mitocondrias y ribosomas). Se usa: Tincin histolgica general. Tincin Hematoxilina - Eosina Tipo: Bicomponente Anfiflica Caractersticas: Los ncleos aparecen en azul (hematoxilina), Los cidos nucleicos asociados a protena (ej. ribosomas) en violeta Fibra muscular en rojo Tejido conectivo en rosado Se usa: Tincin histolgica general. Tincin Hemalumbre - Eosina Tipo: Bicomponente Anfiflica Caractersticas: Es similar a la tincin Hematoxilina y Eosina pero presenta colores ms marcados y definidos.

Tincin tricrmica de Masson Caractersticas: * Los ncleos aparecen en marrn o negro * Queratina y msculo en rojo * Los citoplasmas en tonos de rosa * El colgeno y hueso en azul o verde Tincin con Azul de Metileno Tipo: Supravital metacromtica Caractersticas: Tie de azul oscuro restos de cidos nucleicos, y los proteoglicanos cidos en varios tonos de violeta. Se usa: Diagnstico de anemias regenerativas y demostracin de estructuras metacromticas. Tincin con azul de Prusia Caractersticas: Tie los depsitos de hemosiderina y hierro de color azul-celeste Se usa: Diagnstico de hemopoyesis ineficaz, y hemocromatosis. Tincin de Movat Caractersticas: * Negro = ncleos, fibras elsticas * Amarillo = colgeno, fibras reticulares * Azul = sustancia basal, mucina * Rojo brillante = fibrina * Rojo = msculo

Bibliografa: Texto atlas de histologa Leslie P. Gartner. http://www.medic.ula.ve/histologia/laboratorios/histologiabasica.htm www.pce-iberica.es/instrumentos-de-medida/instrumentos-laboratorios/equiposlaboratorios/microtomos.htm http://www.anditecnica.com/patologia/equipos-para-el-procesamiento-de-muestraspatologicas/microtomos.html http://morfoudec.blogspot.com/2008/07/metodologa-de-la-tcnica-histolgica.html http://es.wikipedia.org/wiki/T%C3%A9cnica_histol%C3%B3gica Edna B. Prophet, Bob mills, Jacquelyn B. Arrington Washington, D.C.(1995) Metodos Histotecnologicos. Freeman, W.H., Bracegirdle, B. (1981) Atlas de histologa. Paraninfo (2 Edicin). Madrid