Técnicas histológicas

HISTOLOGIA:

Del griego Histos: Tejido

Tejido: Asociación de células de naturaleza similar, diferenciadas de modo determinado y

ordenadas regularmente con un comportamiento fisiológico común.

CELULA: Unidad estructural y funcional del tejido. Las primeras investigaciones histológicas fueron
posibles a partir del año 1600, cuando se incorporó el microscopio a los estudios anatómicos. Marcello
Malpighi es el fundador de la histología y su nombre está ligado a varias estructuras histológicas.

En 1665 se descubre la existencia de unidades pequeñas dentro de los tejidos a las cuales
se les denomina “Células”.

El desarrollo de la tecnología ha permitido avances en el conocimiento histológico; entre

ellos podemos citar a la microscopía electrónica, la inmunohistoquímica (uso de anticuerpos marcados con
colorantes fluorescentes dirigidos a un componente celular particular o a una actividad enzimática específica)
y la citoquímica (procedimientos químicos que proporcionan mayor detalle en relación a la composición
celular).

Técnicas histológicas.

Procedimientos que se utilizan para preparar los tejidos para su estudio.

1.- Obtención del material.

2.- Fijación
3.- Deshidratación
4.- Aclaramiento
5.- Inclusión
6.- Microtomía
7.- Montaje y rehidratación
8.- Tinción

1.- Obtención del material. Se puede hacer de varias formas:

- Biopsia
- Frotis por aposición o impronta

2.- Fijación. Es el tratamiento del tejido con sustancias químicas, sirve para retardar las alteraciones tisulares
subsecuentes a la muerte celular (autolisis). Permite que los tejidos permanezcan sin cambios luego del
procesamiento de los mismos. Este procedimiento debe realizarse con inmediatez para que los tejidos no
sufran autolisis y puede durar entre 6 y 24 horas dependiendo del tamaño de la muestra.

La fijación permite que los tejidos se endurezcan, pero sin fragmentarse.

La relación fijador – material fijado debe ser 3:1.

Cualidades que debe tener un fijador.

1. Actuar con rapidez

2. Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta las capas profundas de la
pieza a fijar.
 3. Conservar en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observación ulterior (cortes,
coloración etc).
5. Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después de ella.
6.- No provocar o impedir la formación de estructuras artificiales-
7.- No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables.

Maneras de actuar los fijadores. Varía con la composición o naturaleza de los mismos.

1. Coagulando las proteínas sin combinarse con ellas, ejemplo: Alcohol, ácido pícrico, yodo y el
calor.
2. Formando combinaciones químicas con las sustancias orgánicas como el ácido crómico y sus
sales; o reduciéndose en contacto con las mismas.
3. Originando un precipitado fino como por ejemplo el ácido ósmico, el bicloruro de mercurio y el
cloruro de oro.
4. Oxidándose, favoreciendo la coloración ulterior de los tejidos.

Clasificación de los fijadores.

1. Fijadores químicos
a. Simples, compuestos por una sola sustancia química, son los más usados.
b. Compuestos o mezclas fijadoras, aquellos en los que varias sustancias forman parte
de su constitución.

Fijadores Simples Fijadores compuestos

1. Formol al 10%, es el más usado 1. Líquido de Fleming, mezcla de

porque preserva mayor número de
estructuras, penetración rápida y
uniforme.
2. Alcohol etílico absoluto o de 96º
3. 3. Alcohol metílico, se emplea para
fijar frotis desecados de sangre,
médula ósea, ganglio, bazo y
líquidos de punción entre otros.
4. Ácido ósmico al 1 o 2 %, es poco
penetrante pero conserva bien
estructuras celulares
5. Bicromato de potasio al 3 – 5%
cromo, osmio y ácido acético.
2. Líquido de Zenker, mezcla de
bicromato sublimado y acético.
3. Líquido de Helly, mezcla de Zenker y
formol
4. Líquido de Bouin, mezcla picro -
formos acética.
5. Líquido de Duboscq – Brasil o Bouin
alcohólico
 2. Fijadores físicos
a. Calor seco o húmedo
b. Criodesecación, consiste en someter al tejido a dos procesos el primero es la fijación instantánea por
congelación en Nitrógeno líquido y el segundo desecación por sublimación directa del agua confiada a
vapor en una bomba de vacío es un proceso complicado y costoso pero tiene una ventaja muy
importante y es que al eliminar totalmente el agua tisular, paraliza la autolisis y produce una
conservación indefinida, además evita que se produzcan enlaces químicos entre el tejido y el fijador,
conservando asila estructura antigénica

c. Criosustitución. Es la sustitución lenta y progresiva del agua congelada de un tejido por un líquido fijador
que en ocasiones puede actuar simultáneamente como medio de inclusión. Tras la congelación
instantánea del tejido con nitrógeno líquido o isopentano a -50ºC se coloca el tejido congelado en el
medio de sustitución, este medio está formado por una mezcla de alcohol etílico, acetona y propilén-
glicol. Enfriado a -40ºC, el intercambio del agua tisular por el líquido de sustitución, se realiza dentro de
un congelador y debe procurarse que la temperatura no disminuya del punto de congelación del líquido
de sustitución.

d. Congelación. Se utiliza como método para la fijación el enfriamiento por congelación del tejido es el
método de elección para realizar estudios morfológicos o funcionales en los que se requiere conservar
intacta la estructura antígena del tejido o su contenido enzimático.

La clave para una correcta fijación por congelación del tejido es que su realización sea
instantánea porque un enfriamiento lento provoca la formación de microcristales titulares de hielo que pueden
agregarse con el paso del tiempo produciendo roturas titulares que dificulten el diagnóstico.

Normalmente se preparan bloques de no más de 3 cm. cuadrados de superficie y 3 mm de

espesor de modo que el proceso de congelación instantánea no requiera más de 10 segundos. El
mantenimiento continuo de isopentano debe realizarse en un congelador programado a -70ºC para que quede
compensado la subida inmediata de la temperatura que se produce al extraer el líquido del congelador.

Al enfriar tanto no actúan bacterias ni enzimas y el tejido se endurece para cortar estos
tejidos utilizamos el microtomo de congelación o un aparato más evolucionado o criostato el cual tiene como
ventajas que la temperatura se mantiene más baja y se pueden realizar cortes más finos entre 2 y 15 micras.

3.- Deshidratación. Se emplea para eliminar el agua de los tejidos. Durante la deshidratación el agua es
sustituida por alcohol.

Se puede emplear alcohol etanol o alcohol isopropílico, que es más económico y no es una sustancia
controlada como el etanol.

Se realiza en baños de alcohol incrementando gradualmente el grado alcohólico, el tejido debe permanecer
aproximadamente una hora en cada uno. Generalmente se utilizan tres grados, comenzando por el de 50º a
70º hasta llegar al 100º o absoluto.

4. Aclaramiento. En el aclaramiento el tejido se sumerge en Xilol hasta que el alcohol haya sido sustituido por
este. Sustancias como las grasas y mucinógeno pueden disolverse, lo cual explica que aparezcan espacios
vacíos en los sitios de la célula donde esta se encontraba.
 Con el aclaramiento se busca que el tejido se torne transparente para favorecer el contraste de las
estructuras celulares una vez coloreadas.

5. Inclusión. En este paso se utiliza la Parafina fundida a 46º a 60º, se colocan en receptáculos en los que
se deja enfriar la parafina para formar un bloque de parafina; esto es con la finalidad de darle rigidez a la
muestra para que pueda cortarse y también para que el tejido pueda conservarse usando poco espacio y sin
necesidad de emplear otros químicos.

 Otros métodos de inclusión

a. Metacrilato: Para estudio de biopsias óseas no descalcificadas.

b. Resinas (Epon): Microscopía electrónica

c. Congelación: El tejido en fresco es congelado a temperaturas entre -20º a -40º. Este tipo de
inclusión se usa en las biopsias peroperatorias y en técnicas especiales

d. Celoidina seca o húmeda, su desventaja consiste en que el procedimiento es muy largo, 7 a 10

días para infiltrar el especimen, además no se solidifica porque la celoidina sino que permanece
como gel y para su conservación se necesita alcohol 70º a 80º. La ventaja es que por causar muy
escasa retracción es excelente para conservar embriones.

e. Métodos de inclusión hidrosolubles como la cera carbólica, agar, gelatina y el compuesto de

temperatura óptima (OCT), estos permiten fijar el especimen e incluirlo sin necesidad de
deshidratar y aclarar. Son útiles cuando se quieren preservar sustancias que pueden ser disueltas
por el Xilol o inactivadas por el calor.

6. Microtomía o corte. Se utiliza un equipo de corte denominado Microtomo,

Cada corte debe medir entre 5 – 15 micras de grosor. Los cortes deben ser lo suficientemente
delgados que permita que todas las estructuras incluidas en el corte capten los colorantes y permita el paso
de la luz en el microscopio óptico.

7. Montaje y rehidratación. Se monta el tejido cortado en una lámina portaobjeto, la parafina se elimina del
corte, se rehidrata y se tiñe.

8. Coloración. Los colorantes contrastan las estructuras biológicas incluidas en el corte histológico. Los
colorantes diferencian los componentes ácidos y básicos de las células.

Clasificación de los colorantes.

1. Naturales
a. Animales como el Carmín
b. Vegetales como la orceina, el azafrán y la hematoxilina

2. Artificiales o sintéticos (colorantes de la anilina)

a. Ácidos: Son sales cuya porción acida es la que se colorea. Son colorantes citoplasmáticos. Los
colorantes ácidos tienen carga negativa y reaccionan con los grupos catiónicos de las células
como las estructuras proteicas y del citoplasma celular y colágeno de la matriz extracelular,
produciendo una reacción que se denomina “ACIDOFILIA”. La Eosina o eosinato de sodio, tiñe
de color rosa, es un colorante artificial que presenta autofluorescencia espontánea. Otros
colorantes ácidos son la fucsina ácida, verde rápido y naranja G.
 b. Básicos: Son sales cuya base es la porción que se colorea, los colorantes básicos poseen una
carga positiva y reaccionan con los grupos anionicos de las células como ADN y ARN y algunos
componentes de la matriz extracelular como los glucosaminoglicanos; la reacción que producen
se denomina “BASOFILIA” .Ejemplo: el azul de metileno, la safranina, azul de toluidina y la
hematoxilina son colorantes básicos.

c. Neutros: Son sales en los que se tiñe tanto la base como el ácido, tiñen el núcleo de un color y
el citoplasma de otro. Ejemplo eosinato de azul de metileno.

d. Indiferentes: No forman sales. No se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino
porque se disuelven en ellos. Por ejemplo, el colorante Sudán III se disuelve en los lípidos y por
lo tanto teñirá a las gotas de lípidos, especialmente en los adipocitos.

Tinciones o coloraciones especiales. Se utilizan para resaltar elementos tisulares de manera específica y para
ello se usan colorantes que tienen afinidad por dichas estructuras. Por ejemplo:

1. Reacción del ácido peryódico de Schiff (PAS) tiñe de color magenta moléculas ricas en CHO y
glucógeno.

2. Tricrómico de Masson: Tiñe de azul oscuro los núcleos, azul claro el mucinógeno y de rojo el tejido
muscular, la queratina y el citoplasma.

3. Orceína : Tiñe de pardo a las fibras elásticas.

4. Wreight : Colorea de azul a las fibras elásticas.

5. Hemetoxilina férrica: Colorea de negro las estriaciones musculares, los núcleos y eritrocitos.

6. Tinción Argéntica: Tiñe de negro las fibras reticulares.

7. Mallory: tiñe el colágeno de verde y las células musculares de rojo.

8. Ziel Neelsen tiñe de rojo los BAAR

9. Fontana tiñe la melanina de negro

10. Gomori Grocott tiñe de negro Coccidioides

Cuando un colorante se une al tejido y refleja un color diferente al que tiene en solución se dice que ha
ocurrido un fenómeno de metacromasia. Esto se debe a que las propiedades de absorción de la luz del
colorante cambian al unirse a componentes celulares. Por ejemplo, el azul de toluidina se vuelve púrpura
cuando se une a ciertos gránulos de los mastocitos. Cuando el colorante unido al tejido tiene el mismo color
que en solución se denomina ortocromasia.