-Histotecnologia-

Técnica histológica
Es la ciencia que estudia los fundamentos técnicos y la secuencia de
manipulaciones necesarias para llevar a cabo el análisis de los
tejidos vivos.
Los métodos para la obtención de preparaciones histológicas
ocupadas en los estudios de microscopia óptica. Abarca varios
procedimientos a los que se somete un tejido para proporcionar los
cortes como se conocen, montados bajo un cubre objeto con
imágenes de estructuras contrastadas, para su estudio bajo
microscopia óptica o electrónica.

Preparación De los tejidos

para su observación
microscópica.

Procedimientos:
1. Fijación
2. Inclusión
3. Corte
4. Coloración
Muestra del tejido
Necropsia: examen u obtención de tejido de un organismo muerto
Biopsia: (Del griego bios: vida y oasis: visión) examen u obtención
de tejido de un organismo vivo.
Incisional (de diagnóstico)
Excisional (pieza quirúrgica)
Por sacabocado
Por función y absorción
Por raspado
Por trepanación
La muerte es la interrupción irreversible de los procesos biológicos,
y nada más ocurrir comienzan los procesos degradativos en los tres
niveles:
 Químico: Desciende el PH y se activan los sistemas
hidrolíticos.
 CELULAR: Se alteran las membranas y difunden los
elementos.
 Orgánico: Actúan microorganismos
Para paralizar estos procesos se usan dos procedimientos:
1. Congelación a -120°c (no siempre aplicados por problema
técnicos y de procesamiento posterior)
2. Fijación Empleando sustancias químicas (fijadores) que
mantiene la forma de las estructuras.
-fijación-
Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que de otra
manera iniciarían la AUTOLISIS y llevarían a la degeneración
postmortem.
La fijación mantiene las estructuras al estimular la formación de
enlaces cruzados entre las proteínas.

-fijación de proteínas-
Es necesario evitar su hidrolisis, bloqueando los lugares
susceptibles de hidrolisis mediante cuatro sistemas:
Reticularizacion o desnaturalización:
Creando redes estables empleando aldehídos como formaldehido,
que se usa en solución acuosa al 2% (formalina) para microscopia
óptica y glutararaldehido que se emplea al 2% en tampón, para
microscopia electrónica.
Los agentes más usados para microscopia de luz son:
1. Formaldehido al 5%, formol al 10% o formalina (solución de
formaldehido especial)
 Puede usarse con amortiguadores o con otros fijadores.
 Reacciona con los grupos aminos de las proteínas,
formando enlaces transversales y conservando la
estructura de la célula.
 El más usado es el formol al 10%
2. Glutaraldehido al 2,5%
 Funcionan formando enlaces transversales en las proteínas
y manteniendo las estructuras de la célula.
 Una solución de glutaraldehido al 2,5% en un tampón a PH
7,4% evita la violenta desnaturalización de las proteínas
guardando detalles finos de la célula
 Es es el más usado en la microscopia electrónica.
Formación de sales insolubles
Mediante productos como el ácido pícrico empleado en la
confección del fijador del BOUIN; el cloruro de mercurio (muy
toxico) y el dicromato potásico.
 El fijador de BOUIN es una solución que contiene 75ml de
solución acuosa saturada de ácido pícrico, 25ml de formol y
5ml de ácido acético glacial
  El líquido de HELLY es una solución con 2,5% g de bicromato
de potasio, 5g de cloruro de mercurio, 100ml de agua y 5ml
de formol.
Cambios en el estado coloidal, mediante el calor (no
recomendable)
MODIFICACION DEL PUNTO ISOELECTRICO, CON
ACIDO ACETICO.

Para microscopia electrónica se usan:

 Glutaraldehido al 2,5%, Paraformaldehido, Tetroxido de
osmio y Permanganato de Potasio.
 Permiten conservar detalles estructurales finos, ya que otros
fijadores como el formaldehido, son muy enérgicos en su
acción con las proteínas
 Actúan como colorantes electrodensos, permitiendo observar
al tejido con el haz de electrones.

Fijación de los hidratos de carbono

Es necesario evitar que se disuelvan en agua, para ello hay que
extraer el agua mediante fijadores cuya avidez por el agua sea
mayor que ellos, así se emplea alcohol etílico (al 70% en agua), y
acetona. Tienen el inconveniente que retraen los tejidos y los
endurecen para el procesamiento posterior.

Fijación de los lípidos

Es necesario evitar su oxidación (entanciamiento) bloqueando los
lugares donde existen enlaces –CH=CH – mediante sustancias como
tetroxido de osmio (ácido osmico), es el fijador ideal para
microscopia electrónica, pues se fija en los dobles enlaces de
cadenas laterales de los lípidos de las membranas plasmáticas, y
además el OS es un metal opaco a los electrones (sirve de tinción)

Tiempo para la fijación: La mejor fijación es cuando ha

pasado el menor tiempo entre la muerte del tejido y la fijación.

Tamaño de la muestra: El tamaño de la muestra debe ser de

2-3 cm, variando el estudio para lo cual se va a utilizar.

Deshidratación (dentro de la fijación)

 Después que la muestra ha sido fijada se elimina el
fijador y se deshidrata
 Debido a que una gran parte del tejido está constituida
por agua, se aplica una serie gradual de soluciones
acuosas de menor a mayor de agente deshidratante,
por ejemplo, alcohol etílico o acetona, iniciando con
alcohol al 50%
 Luego con una solución de 60%, 70%, 80%,90%, 96% y
alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100%
para eliminar el agua
 Esto se hace porque si se colocara el tejido en una
solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua
saldría muy rápida del tejido y se deformaría.
Aclaramiento o diafanizacion
(fijación)
Luego de deshidrata el tejido, se pasa a una solución de una
sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio
de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza como
medio de inclusión parafina liquida).
La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno o Xilol, también se
puede utilizar Tolueno, Benzol, o Cloroformo como medios de
aclaramiento
Se coloca la muestra del tejido en un recipiente de Xilol, el Xilol solo
es soluble en alcohol al 100% .
Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro
en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción.
El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de las células y por lo cual
al extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de las
células.

Inclusión o impregnación
Los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia
de consistencia firme (medio de inclusión) para tener un objeto lo
suficientemente duro para su manejo y corte. Así se puedan
obtener cortes suficientemente finos para ser observados al
microscopio, y distinguir entre si las células superpuestas en un
tejido y la matriz extracelular.
Las sustancias usadas son: gelatina y parafina.
La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio
de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de
aclaramiento y penetra en el tejido. Por lo general se coloca la
muestra del tejido en un recipiente y se le agrega la parafina
fundida a 60°c, colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a
6 horas manteniendo la temperatura a 60°c.
Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios
anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la
parafina. Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida
en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja
solidificar a temperatura ambiente, formándose un bloque solido
de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se lo llama
taco.

Sección o corte
El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente
delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los
preparados para microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10
um. Para estos cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO.

Técnica de congelación de tejidos:

 Grasas o lípidos que se extraen en el proceso de aclaramiento
 Enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la
inclusión
 Un tejido congelado, es lo suficientemente duro para ser
cortado
 Muestra en nitrógeno líquido (congelación rápida)

Micrótomo de congelación o criostato:

Ventajas:
 Los cortes que se obtienen son muy rápidos.
 Se puede utilizar en el diagnóstico de material patológico,
tomado en intervenciones quirúrgicas y el resultado se
obtiene en el transcurso de una operación.

CORTES GRUESOS:
 Vibratomo
 Micrótomo de vibración
 20 a 50 um
 Montaje en portaobjetos (dentro del corte)
Los cortes todavía no son aptos para su examen con el
microscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados en
parafina y carecen de color.
Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha
agregado una pequeña cantidad de Albumina, la cual actúa
como adhesivo.
Disolución de parafina e hidratación
(corte)
La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo se
incluyen en Xilol, y la muestra se rehidrata haciéndola pasar
por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico
hasta llegar a una solución 100% de agua.
Coloración o tinción
Ya rehidratado se tiñe el tejido, los colorantes más utilizados
son la hematoxilina y la eosina.
Deshidratación y montaje del
cubreobjetos (coloración)
Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera que
pueda fijarse de modo permanente el cubre objetos con un
medio adecuado para el MONTAJE (por ej: una gota de
bálsamo de canada o similar).
Los medios de montaje pueden ser miscibles o no miscibles en
agua, si son miscibles en agua ya no es necesaria la
deshidratación después del teñido, se puede directamente.
El cubre objetos no solo protege el tejido, sino que se
requiere para observar el corte con un microscopio.
 Placas histológicas. Resultados de como
quedarían:
 Portaobjeto
 Corte o tejido
 Cubreobjetos
Coloración
 Una estructura tisular o celular adquiere un color específico
bajo la acción de una sustancia colorante.
 Métodos físicos
 Métodos químicos

Colorantes:
Pueden agruparse en tres clases:
1. Colorantes que diferencian los componentes ácidos y
básicos de la célula.
2. Colorantes especializados que distinguen los componentes
fibrosos de la matriz extracelular.
3. Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman
depósitos de metales con ellos (impregnaciones)

Fundamentos químicos de la coloración h-e (tinción de

Mayer)
 La EOSINA es un colorante ácido y sus propiedades tintoriales
pueden ser explicadas sobre la base de lo que se sabe acerca
de la acción de las anilinas acidas.
 La HEMATOXILINA aunque no es un colorante básico, posee
propiedades muy semejantes a las anilinas básicas.
Colorantes básicos Colorantes ácidos
Verde de metilo (verde) Fucsina acida (rojo)
 Azul de metileno (azul) Azul de anilina (azul)
Pironina G (rojo) Eosina (rojo)
Azul de toluidina (azul) Naranja G (naranja)

Hematoxilina
Un colorante básico es una molécula de anilina que tiene una o más
cargas positivas en su porción coloreadas y su fórmula general se
representa:
ANILINA+CI-
Los COLORANTES BASICOS reaccionan con los GRUPOS ANIONICOS
de los componentes texturales, que son los grupos FOSFATO de los
ácidos nucleicos (ADN Y RNA), los grupos SULFATO de los
glucosaminoglucanos y los GRUPOS CARBOXILO de las proteínas. La
reacción de estos grupos varía según el PH
La HEMATOXILINA no es un colorante básico en sentido estricto, se
la utiliza como un mordiente (intermediario) entre el componente
textural y la anilina, y es debido a este que la coloración con
hematoxilina se asemeja a la tinción que produce un colorante
básico.
La unión en el complejo TEJIDO-MORDIENTE-HEMATOXILINA no
consiste en un simple enlace y cuando la hematoxilina se coloca en
agua no se disocia del tejido, sino que permanece firmemente
adherida. A causa de esto la hematoxilina se presta para aquellos
procedimientos tintoriales en los que a ella le sigue la Eosina u
otros colorantes ácidos.
Los colorantes básicos verdaderos no suelen usarse en secuencia en
donde el colorante básico es seguido por uno acido, porque la
anilina básica tiende a disociarse del tejido durante los lavados
posteriores en soluciones acuosas.

EOSINA
Un COLORANTE ACIDO lleva una carga negativa en la porción
coloreada de la molécula y su fórmula general se representa:
NA+ANILINA-
Los colorantes ácidos se unen primariamente a los componentes
texturales por medio de enlaces electrostáticos de manera similar
pero opuesta a la de los colorantes básicos.
Las anilinas acidas reaccionan con grupos catiónicos, como los
GRUPOS AMINO IONIZADOS de las proteínas.
Cualquier componente de los tejidos que reaccione con un
colorante básico (o con hematoxilina) se dice que es BASOFILO y
que presenta BASOFILIA, estos componentes son:
 La heterocromatina y los nucléolos del núcleo por los grupos
fosfato ionizados.
 Ergatoplasma (parte del citoplasma) por grupos fosfato
ionizados.
 Matriz del cartílago por grupos sulfato ionizados.
Los componentes texturales que se tiñen de colorantes ácidos se
dice que son ACIDOFILOS y que presentan ACIDOFILIA. Son
acidofilos:
 La mayor parte del citoplasma no especializado.
 Filamentos citoplasmáticos.
 Fibras extracelulares.
Todos estos debidos a grupos amino ionizados.
Otras tinciones.
Impregnaciones argenticas. Reducción.
Azul de tolouidina: Purpura a sustancia fundamental del cartílago y
en los gránulos de los mastocitos (glucosaminoglucanos sulfatados
y las nucleoproteínas)

Corte semifino, del epitelio vaginal de la rata, localice el estrato

espinoso y con gran aumento, los desmosomas que establecen las
células epiteliales entre sí.
Método del ácido peryodico-reactivo de schiff (pas); Rojo estable a
membranas basales y fibras reticulares (glucógeno, glicoproteínas y
glicosaminoglicanos)
Sección histológica de intestino delgado cortado en congelación y
teñido con (PAS) e identifica el glicocalix.

ORCEINA; Afinidad particular por DNA, fibras elásticas.

Microscopia electrónica
 Medio de inclusión son resinas polimerizadas o epoxi
 Cortes más delgados (ultra finos) de 25 a 100 nm de espesor y
de 0.5mm de lado medio
 Micrótomo con hoja de vidrio o diamante (ultramicrotomo)
 Montaje sobre rejillas de cobre con un diámetro de 3mm
Planos de corte histológico:
 Corte longitudinal: Es el corte que se hace paralelo a la mayor
dimensión de la estructura
Corte transversal: Es el corte que se hace de manera
perpendicular al eje longitudinal de la estructura.
Corte tangencial: Es el corte que se realiza tocando apenas la
superficie de la estructura, también se le denomina rasante.
Corte oblicuo: Cuando se corta la estructura en un angulo que
este comprendido entre los dos planos anteriores (longitudinal y
transversal)

Conclusión
Las estructuras a observar en una placa histológica, depende del
corte que tenga el tejido, así que de eso depende que una
estructura como un conducto por ejemplo se vea alargado, ancho,
corto, redondo, triangular u de otra forma.
Por esta razón es importante considerar siempre:
1. El órgano a estudiar
2. El plano del corte.
Para precisar el diagnostico, también se debe contar con:
3. El aumento de la observación.
4. La tinción.
Tejidos
Conjunto organizado de células iguales, del mismo origen
embrionario, más la sustancia que las rodean, desempeñando en
conjunto una misma función.
 Células
 Matriz extracelular: inexistente o abundante (estructuras y
macromoléculas)

CUATRO TIPOS:
1. Epitelial
2. Conectivo
3. Muscular
4. Nervioso