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Histotecnologia Guia
Fijación: Consiste en interrumpir los procesos de degradación que aparecen tras la muerte celular.Trata de
conservar la arquitectura y composición tisular lo más parecida como se encontraba cuando el organismo estaba
vivo.
Principios generales de la fijación
No existe un método universal de fijación lo que es igual, un agente fijador, adecuado para un tejido puede no
serlo para el otro.
No todos los fijadores conservan indefinidamente los tejidos ya que fijación no es equivalente a conservación
tisular.
Como se ha mencionado un defecto de fijación jamás puede ser corregido.
Es inútil realizar un estudio histológico sobre un material con defectos e fijación.
Líquidos fijadores simples:
Fijadores que actúan por deshidratación tisular: los principales son el alcohol etílico, alcohol metílico, la acetona
y el cloroformo.+
Alcohol etílico (CH3-CH2OH): preparación 70-90ml de alcohol y se lleva a 100ml con H2O destilada.
 Preserva el glucógeno y la actividad de ciertas enzimas tisulares.
Ventajas
 fija y deshidrata el tejido al mismo tiempo.
 Rápida penetración.
 Precipita rápidamente las proteínas y el glucógeno.
 Es un notable agente bactericida.
Inconvenientes:
 Es un fuerte reductor.
 No fija adecuadamente la cromatina.
 Pierde rápidamente su actividad.
Acetona: (CH3-CO-CH3): preparación general mente sin diluir a 4º.

Tipos de fijación
En función al tipo de estudio histológico que se vaya a realizar, se distinguen dos tipos de fijación celular:
 La fijación histológica: pretende conservar la arquitectura y morfología de la célula sin cambiar o inducir su
estructura bioquímica.
 La fijación histoquímica: para la cual es más importante conservar la estructura molecular y bioquímica, para
realizar coloraciones especiales e inmunohistoquimica.
 Él lo que respecta a las fases del proceso de fijación deben de distinguirse a la fijación inicial, es la que se realiza
cuando el tejido está fresco de forma inmediata.
 La fijación secundaria o refinación que consiste en colocar un tejido ya fijado es un segundo fijador para demostrar
algún componente tisular específico.

Fijadores que actúan por el cambio en el estado coloidal de las proteínas:


Ácido acético: (CH3-COOH) preparación se utiliza diluido en concentraciones entre 1 y 5 por 100 y forma parte de
las mezclas fijadoras y soluciones descalcificantes.
Ventajas:
 Es el fijador ideal para nucleoproteínas y ácidos nucleicos.
 No es higroscópico
Inconvenientes:
 Es un mal fijador para membranas y citoplasma celulares.
Destruye las mitocondrias
Ácido tricloroacetico: (Cl3C-COOH) preparación se emplea en concentraciones de 2,5% a 5%.
Ventajas
 Es una excelente solución descalcificadora.
 Fija adecuada mente todo tipo de estructuras nerviosas.
Inconvenientes
 Disuelve las nucleoproteínas y ácidos nucleicos.
 hinchazón excesivo de los tejido
 Provoca artefactos.

Acido crómico (H2CrO4) preparación se emplea por disolución de anhídrido crómico en H2O y su concentración
está al 2%.
Ventajas
 Es un excelente fijador estructural.
 Posee un fuerte agente oxidante actúa como mordiente.
Inconvenientes
 Posee una escasa velocidad de penetración.
 Impregna de una coloración verdosa a los tejidos.

Fijadores que actúan por formación de sales con los tejidos:


Cloruro de mercurio (HgCl2): preparación se emplea en soluciones acuosas saturada.
Ventajas
 Es un excelente fijador de los caracteres morfológicos celulares.
 Es un excelente mordiente.
Inconvenientes
 No es un buen bactericida.
 Tiempo cuidadoso para la fijación.
 Originan artefactos metálicos de color pardo.
Dicromato de potasio (K2Cr2O7) preparación se emplea por disolución acuoso y su concentración esta entre el
1% y 2%.
Ventajas
 Posee un fuerte efecto mordiente.
 Excelente fijador para los lípidos complejos.
Inconvenientes
 Baja velocidad.
 Provoca artefactos tisulares.
Fijadores que actúan por reticularizacion de las proteínas
Formaldehido o formol (CHOH): en estado puro es un gas toxico y muy irritante para la mucosa, la concentración
comercial está entre 35% y 40% y se estabiliza con metanol, por acción del frio se tiende a precipitar hacía para-
formaldehido situación que es reversible añadiendo unas gotas de hidróxido de sodio y calentando la muestra.
Ventajas
 Es el fijador más barato.
 Es un buen desinfectante y no endurece excesivamente los tejidos.
 Buena velocidad de fijación.
 Compatible con la gran mayoría de las tinciones.
Inconvenientes
 Produce abundantes vapores irritantes.
 Se transforma progresivamente en acido fórmico por acción de la luz y oxigeno atmosférico.
 Se consume durante la fijación por la elaboración de puentes metílicos con el tejido.
 Posee relativa capacidad de fijación sobre las proteínas, pigmentos que confiere el hierro y los derivados de la
bilirrubina.
 Soluciones fijadoras simples que contienen formaldehido:
 Formol salino: se utiliza para prevenir el efecto osmótico que provoca el empleo de las disoluciones de
formaldehido en H2O destilada.
Preparación: disolver 9 gramos de cloruro de sodio en 1000ml fe formalina al 10%
 Formalina neutra: es una solución al 10% la cual se le agrega una pequeña cantidad de carbonato cálcico.
 Formol tamponado: preparación
Formalina pura………………………………………………100ml
Fosfato sódico monobásico………………………………...4g
Fosfato sódico difásico…………………………………….6, 2
Agua destilada ……………………………………………...900ml aproximado.
Formalina acida: se emplea para fijar tejido nervioso en la preparación de algunas técnicas de impregnación
argentica.
Preparación: agregar gotas de ácido acético glacial a una solución de formalina al 10% hasta que su pH cambie a
2.
Glutaraldehido: liquido oleoso que en el comercio se encuentra en disoluciones al 25%
Preparación: se emplea en soluciones del 1% al 3%.
Ventajas:
 Es el fijador por elección para microscopia electrónica.
 Se emplea en fijación de animales por perfusión.
Inconvenientes:
 Velocidad de penetración excepcionalmente baja.
 Gran capacidad de retracción y endurecimiento.
Mesclas fijadoras

Mesclas de fijadoras que contienen formol


 Liquido de Bouin.
 Bouin- hollander
 Bouin alcohólico
 Liquido de Gendre
 Fijador de Müller
 Fijador de orth
 Solucion de Zenker-formol

La inclusión es el proceso en el cual el tejido es rodeado de una sustancia liquida la cual mediante alcanzar su punto de
fusión tomara una consistencia firme, con la finalidad de conferirle soporte al tejido que se dé sea seccionar al micrótomo.
La parafina es uno de los medios de inclusión más utilizados en histotecnólogia, sin embargo debemos tener en mente los
demás medios de inclusión existentes en esta área.
Medios de inclusión
Hidrofilicos: Gelatina. Y O.C.T (Compuesto de temperatura Óptima).
Hidrofóbicos: Parafina. Y Celoidina
Gelatina: Se utiliza para la inclusión de piezas grandes y cuando se requieren cortes en congelación. Es soluble en
agua, por lo que no es preciso deshidratar el tejido; sin embargo el fijador debe ser completamente eliminado del
tejido. La gelatina tiene un punto de fusión bajo, de esta manera no sufren con el calentamiento. La inclusión se hace
en infiltraciones sucesivas de tipo crecientes a 37 °C. Produce escasa retracción en los tejidos.
Parafina: La parafina es una mezcla de hidrocarburos sólidos derivados del petróleo. La parafina es blanca o Incolora,
más o menos translucida, inodora y hay varias. Cada una con un punto de fusión diferente: Las parafinas más blandas
tienen un punto de fusión alrededor de los 45 °C y funcionan mejor con tejidos blandos. Las parafinas duras se derriten
cerca de los 60°C y son las mejores para tejidos duros tales como el tejido óseo y fibroso denso.
Celoidina: Es una forma purificada de nitrocelulosa, que se obtiene tratando celulosa con ácidos sulfúrico y nítrico. Se
recibe como material algodonoso que se ha llamado también “algodón pólvora”. La celoidina no requiere calor
durante ninguno de los pasos del procesamiento y por lo tanto se recomienda para la infiltración e inclusión de
especímenes que puedan ser afectados por soluciones caliente.
• Entre sus principales desventajas son que consume tiempo de 7 a 10 días para infiltrar el espécimen, atrae la
humedad muy rápidamente, es extremadamente difícil obtener secciones de menos de 10 micras.
• Sus principales ventajas son que causa menos contracción y endurecimiento de los tejidos que la parafina,
excelente para el estudio de embriones y especímenes grandes.
MEDIOS DE INCLUSIÓN EN MICROSCOPIA ELECTRÓNICA: Para la observación de la ultraestructura celular es necesario
hacer secciones de tejido muy delgadas, del orden de nanómetros, denominadas ultrafinas, y usar un microscopio
electrónico de transmisión. La obtención de secciones ultrafinas implica que tenemos que endurecer enormemente
el tejido.
Orientación del espécimen: La calidad y utilidad final de una sección de tejido depende de la ejecución impecable de
cada uno de los pasos del procesamiento; cada paso, a su vez, dependerá completamente del paso anterior si se desea
calidad óptima. Aún con fijación adecuada, procesamiento impecable, y microtomía profesional, una sección de tejido
puede ser destruida, si la inclusión, la localización y la orientación no son adecuadas.
O.C.T (Compuesto de temperatura Óptima): Es un medio hidrosoluble usado rutinariamente en secciones por
congelación. Es un medio sintético que favorece la realización de cortes en Criostato a temperaturas muy bajas (-
20ºC). Esta característica permite la inclusión de la biopsia sin fijación previa, ya que a esa temperatura se detienen
los procesos postmortem del espécimen y la hace apta para estudios de lípidos, enzimas e inmunohistoquímicos.
EQUIPOS PARA LA INCLUSIÓN
Centros de inclusión: Son sistemas multifuncionales que usualmente incluyen un proveedor de parafina, un tanque
para mantener los especímenes, una placa de temperatura tibia para orientar el espécimen en la parafina derretida y
una placa fría para transformar la parafina derretida en un bloque sólido luego de que el espécimen haya sido
orientado. Estos centros de inclusión pueden ser adquiridos como unidades modulares
MATERIALES NECESARIOS PARA LA INCLUSION
Moldes de inclusión: Se usan para solidificar la parafina liquida y convertirla en bloques. Los hay de varias clases. Los
moldes de acero inoxidable son tal vez los que más se usan y son considerados como ideales para propósitos
relacionados con el proceso de inclusión.
Moldes plásticos: Son desechables, eliminándose así la necesidad de la limpieza periódica. Son poco profundos y
requieren una cajilla de inclusión o un anillo que vaya con cada molde para sostener los bloques durante el proceso
de corte.
Piezas en L: Son dos piezas en forma de letra L que se colocan sobre una superficie plana y se pueden mover para
variar el tamaño del molde de acuerdo al tamaño del tejido.
Unidades de inclusión múltiple: Permiten la inclusión simultánea de varios bloques. Estas unidades constan de una
serie de bandas conectadas en una bandeja.
La Microtomía es la disciplina que se ocupa de la obtención de finos cortes seriados a partir de tejidos incluidos en
bloques de parafina para su posterior estudio a microscopía óptica y/o electrónica, lo que la convierte en uno de los
pilares básicos delas técnicas procedimentales de Anatomía Patológica.
El microtomo (o micrótomo) es un aparato mecánico que permite la obtención de secciones de tejido de espesor
micrométrico que pueden ser empleadas posteriormente para su estudio al microscopio. Los micrótomos poseen
cuchillas de metal y mecanismos para regular el grosor de los cortes y el avance de la muestra que se coloca en él. Se
utilizan para estudiar secciones de tejidos potencialmente patológicos de los que se pretende obtener un diagnóstico.
Portabloques: Propiamente se denomina portabloques al dispositivo donde colocamos el material tisular sumergido
en algún medio de inclusión, generalmente parafina. Los actuales portabloques llevan un sistema de pinzas que se
adaptan a cualquier tipo de base o molde. A su vez, el portabloques lleva un sistema de orientación que permite
conseguir la posición en paralelo entre el bloque y la cuchilla.
Portacuchillas: consiste en un dispositivo de fijación basado en una pinza que sujeta y orienta adecuadamente la
cuchilla. Esta pinza permite variar el ángulo de inclinación de la cuchilla, así como su grado de aproximación al
portabloques.
Mecanismo de avance del portabloques sobre la cuchilla: sistema mecánico o electrónico que proporciona cortes
sucesivos de tejido a partir del bloque. Actualmente se consiguen cortes de hasta 1µ
Base: sirve para sustentar el micrótomo a la mesa.
Caja: también llamada carcasa, aloja el mecanismo de engranajes de precisión y el mecanismo para seleccionar el
espesor de la sección.
Manivela: está situada a la derecha del aparato; consiste en un volante con una manilla y un freno. En el volante hay
una flecha pintada que indica la dirección en la que se debe mover la manivela.
Freno: es un tornillo que, accionándolo hacia afuera y/o girándolo sobre sí mismo un cuarto de vuelta, libera la
manivela.
Micrótomo de Oscilación: Posee un sistema de avance de tornillo y las secciones se obtienen por un sistema oscilatorio
que realiza la porta bloque sobre la cuchilla al oscilar sobre ella.
Ventajas: simplicidad y bajo coste
Desventajas: no permite obtener secciones seriadas.
Micrótomo de Rotación: Ha sido el más empleado en anatomía patológica. La porta bloque colocado en posición
vertical se mueve de arriba abajo. Delante del filo de la cuchilla El porta bloques avanza de manera automática y
constante, en cada vuelta del mango.
Ventajas:
• Al tener más peso, tiene más precisión, permite obtener secciones seriadas muy finas.
• El mecanismo de avance es más exacto.
Desventajas:
• El elevado precio debido a la complejidad del mecanismo de avance, que además dificulta y encarece las
reparaciones.
• La imposibilidad de cortar con él tejidos incluidos en celoidina, en gelatina y en propilén glicol.

Micrótomo de Rotación: Ha sido el más empleado en anatomía patológica. La porta bloque colocado en posición
vertical se mueve de arriba abajo. Delante del filo de la cuchilla El portabloques avanza de manera automática y
constante, en cada vuelta del mango.
Ventajas:
• Al tener más peso, tiene más precisión, permite obtener secciones seriadas muy finas.
• El mecanismo de avance es más exacto.
Desventajas:
• El elevado precio debido a la complejidad del mecanismo de avance, que además dificulta y encarece las
reparaciones.
• La imposibilidad de cortar con él tejidos incluidos en celoidina, en gelatina y en propilén glicol.
Micrótomo de Deslizamiento: Existen principalmente dos tipos según se movilice el portabloques, sobre la cuchilla
permaneciendo esta fija, o viceversa, en ambos casos. El movimiento que produce el corte es el avance y retroceso
de la porción móvil sobre unas guías metálicas.
Ventajas:
-Por su diseño ocasiona pocas averías.
-Permite regular de forma exacta la presión de la cuchilla sobre el tejido.
-Debido al tamaño de la cuchilla permite seccionar bloques titulares de gran tamaño.
-Por la disposición de esta cuchilla permite cortar bloques incluidos en celoidina.
Inconvenientes:
-No permite realizar cortes seriados, con lo cual se enlentece el proceso.
-La exposición de la cuchilla puede provocar accidentes
-Es casi imposible obtener secciones de un espesor inferior a 8 micras
Micrótomo de Congelación: Se utiliza para efectuar secciones de tejido congelado y por tanto no deshidratado. La
congelación se consigue haciendo circular CO2 por el interior del portabloques procedente de una bombona y de esta
forma el gas cuando se expande provoca el enfriamiento del tejido. Una vez congelada las secciones de trabajan con
una cuchilla que se encuentra sobre un eje fijo de manera que el avance lo realiza el portabloques por un mecanismo
directo del tornillo.
Criostato o criotomo: Colocado en un mueble frigorífico con una tapadera en la parte superior y tiene una manivela
que se mueve desde fuera consta de un micrótomo de tipo Minot. Semejante al convencional de parafina que está
incluido en una cámara de congelación permite obtener cortes de material sin fijar a -20ºC o incluso a -60.
Ultramicrótomo: Prácticamente es un derivado del de tipo Minot pero con mejorar técnicas que permiten efectuar
secciones de manómetros de espesor incluso en plásticos. Se obtiene en microscopia electrónica.
Tiene una platina, portacuchillas regulable apta para cuchillas de vidrio o diamante, El sistema óptico tiene un
microscopio o una lupa binocular incorporado mediante un motor se regula el brazo de avance tiene una unidad de
control independiente con selectores para avance macro y micrométrico regulable en amplitud y velocidad. El
portabloques es una pinza redondeada como la de los taladros.
1. Bicóncava por ambas caras: se utiliza para cortar bloques de parafina blanda en el micrótomo de balanceo o de
rotación.
2. Plano-cóncavas: También se llaman de tipo A y B según sea mayor o menor el grado de concavidad de la cara no
aplanada. Lo de tipo A se usa para bloques de parafina en el micrótomo de deslizamiento y la de tipo B se utiliza para
bloques en celoidina.
3. Cuchilla biplano en cuña: o de tipo C que se utiliza indistintamente para cortes criostáticos en congelación de
parafina de tipo Minot. Este tipo se ha impuesto por su fácil mantenimiento y su mayor rapidez cuando la dureza de
los tejidos oscila notablemente.
4. Biplana: O de tipo D. Se utiliza para cortar material congelado con el micrótomo de gas carbónico o cuando el tejido
es muy duro
Técnicas de Corte
Si no trabajamos el freno ha de estar puesto-No se toma la cuchilla con las manos, cuando no se utiliza la cuchilla se
pone una pieza que se llama guardas.
Antes de empezar a cortar hay que tener preparado el material. Hay que preparar placas de parafina frías con hielo
para mantener fríos los bloques, prepararemos portas, lápices de grafito, agujas histológicas…
Se enchufara el baño de flotación programando la temperatura entre 45-50 grados. Se debe comprobar
periódicamente esta temperatura, con el termómetro.
Se añadirá al baño una pequeña cantidad de gelatina en polvo, o bien que los cortes se adhieran al portaobjetos.
Tallado y enfriamiento del bloque
• Retallar un bloque es eliminar el exceso de medio de inclusión que existe en su periferia para disminuir la
superficie total en contacto con la cuchilla.
• Con esto se consigue que el bloque oponga solo la resistencia al corte propio del tejido.
• Después el bloque debe enfriarse para conseguir una consistencia óptima de la parafina. Se debe colocar a 4ºC si
se colocara a menos de 0 la parafina tiende a cristalizar y se resquebrajaría los bloques apareciendo artefactos en
los tejidos.

Ángulos en Microtomia
Ángulo de inclinación: cara inferior de la cuchilla y el plano de corte sobre el bloque. 10-15°
Ángulo libre: entre el plano que pasa por la faceta interior de corte de la cuchilla y la superficie del corte.
Complementario al ángulo de corte.
Ángulo de corte: determinado por el plano que se apoya sobre la faceta superior del filo de la cuchilla y la
superficie del bloque. 60°
Ángulo de arrastre: formado por el plano superior de la faceta de corte de la cuchilla y la perpendicular al plano
del bloque. 5°
Orientación del bloque: Colocar el boque retallado sobre el portabloques y orientarlo de manera que quede
paralelo al filo de la cuchilla, para orientarlo había 2 tornillos. Se quita el freno y se hace descender el brazo hasta
que la superficie del bloque entre en contacto con la cara interna de la cuchilla de desbastado. Se comprueba que
queden paralelos y si no se restablece mediante la manipulación de los tornillos.
Desbastado y selección del espesor de los cortes: Para tejidos incluidos en parafina, lo 1º que hay que hacer es
desbastar para eso se ponen 20 micras y se elimina la 1º capa de parafina. Cuando vemos que empieza a salir
tejidos se cambia el selector de micras y se pone a la que nos convenga.
El espesor final será de 2 a 5 micras, se utiliza el corte de 10 para tejido nervioso que tiene baja celularidad, los
cortes más delgados son difíciles de obtener, son útiles en patología renal, hematopoyéticas y linfoide
Baño de Flotación :Están constituidos por un tanque fabricado en material inoxidable, el cual tiene montado en la
parte inferior del mismo un conjunto de resistencias eléctricas mediante los cuales transfieren calor a un medio
como agua o aceite, que se mantiene a una temperatura preseleccionando a través de un dispositivo de control.
CARACTERÍSTICAS: Baño de flotación para cortes de parafina
• Parte interior fabricado en aluminio anodizado de color negro para una óptima visualización de los cortes
• Parte exterior recubierto de epoxi
• Regulación de temperatura desde ambiente hasta 90°C
• Presión +- 105°C
• Capacidad: 1.7 litros (3)
Estirado de los cortes y confección de los cortes y confección de las preparaciones:
• Se coloca el corte en el baño de flotación de manera que la cara brillante o inferior quede en contacto con el H2O
al estar en H2O entre 45-50 grados el corte se estira debido a la tensión superficial y flota, si existen pliegues se
suelen estirar al ponerlas en el baño.
• Después procederemos a la captura de los cortes con nuestro portaobjetos enumerado, si nos sale mal podremos
volver a reflotar y tomar.
Secado de los cortes: Antes de iniciar el proceso de coloración hay que secarlos para evitar los desprendimientos.
La desecación se puede realizar de distintas formas. La desecación puede hacerse de esta forma rápida
introduciéndose el portaobjeto en una gradilla y está en una estufa que se encuentra previamente a 60 grados
durante 30-35 minutos.
Defectos de la microtomia
Sección demasiado gruesa
• Ajuste erróneo del micrómetro
• Aplicación de aliento caliente a un bloque frío para facilitar el seccionamiento
• Elección de la primera sección en la cinta
• Seccionamiento a demasiada velocidad.

Líneas de cuchillas
• Se utilizan cuchillas dañadas
• Procesamiento pobre
• Material duro como el calcio en un bloque

Disgregación
• Tratamiento basto de la muestra durante la expansión
• Procesamiento pobre (infiltración, compensación o deshidratación incompleta)
• Tratamiento vigoroso para quitar las arrugas durante la flotación
• Dejarla flotando demasiado tiempo o utilizar agua que está demasiado caliente

Micro rugosidades
• Tejido excesivamente procesado
• Bloque demasiado frío
• Corte demasiado rápido

Rugosidad basta
• El mecanismo de abrazadera no
Está bloqueado de forma segura
• Muestra grande o muy dura
• Procesamiento pobre

Pliegues
• Técnica de flotación inadecuada
• Procesamiento y/o fijación inadecuados (soporte insuficiente)
• Bloque caliente
• Sección demasiado fina

Excesiva compresión
• Procesamiento pobre (soporte insuficiente)
• Bloque caliente
• Corte demasiado rápido • cuchilla desafilada
• Ángulo de incidencia demasiado grande
• Parafina de mala calidad

Artefactos
• Portaobjetos sucio
• Baño de flotación sin quitar la espuma o baño contaminado
• Portaobjetos drenados, secos o almacenados en un entorno polvoriento
• Fragmentos de mina de lápiz del etiquetado

Mala Adherencia
• Sección de mala calidad (arrugas, burbujas)
• Baño de flotación demasiado frío
• Uso de un portaobjetos sin recubrimiento

Sobre expansión de la flotación


• Temperatura del baño demasiado elevada
• Se ha dejado la sección demasiado tiempo en agua
• Procesamiento y/o fijación pobre (disolvente residual).
Cuestionario
1. Que es la fijación
2. Defina
3. Biopsias, microtomia, inclusión, decalcificación, criostato,baño de flotación
4. Nombre los pasos del proceso histológico
5. Métodos de inclusión
6. Mesclas fijadoras que contienen formol
7. Partes del micrótomo
8. Fijadores que actúan por formación de sales con los tejidos
9. Nombre las normas para una buena decalfiicacion
10. Fijadores con poder declficicante
11. Angulos de microtomia
12. Tipos de biopsias
13. Tipos de micrótomos
14. Fijadores simples
15. Materiales a utilizar en la inclusión
16. Nombre y explique los defectos de la microtomia 4