MEDIOS DE FIJACION

Fijadores fisicos
• Puede ser por en una congelación muy rápida
del tejido, en la aplicación de calor o
microondas.
• Se utilizan cuando el tipo de muestra lo
requiere, cuando los fijadores químicos
alteran la estructuras que queremos
observar, o cuando necesitamos una fijación
muy rápida.
• La congelación rápida es un buen método de
preservación de las caraterísticas
moleculares y es conveniente que sea rápida
puesto que así se impide la formación de
grandes cristales de hielo que nos
destrozarían la estructura del tejido
Fijadores fisicos
• La criodesecación o lifilizacion.-
Parte de tejido previamente
congelado, pero posteriormente se
realiza una sublimación del hielo,
es decir, el agua pasa de estado
sólido a gaseoso sin pasar por
estado líquido
• La criosustitución también parte de
tejido congelado pero en este caso
se produce una sustitución lenta
del hielo por una solución fijadora
Fijadores quimicos
Utilizan soluciones acuosas
compuestas por moléculas fijadoras
que establecen puentes entre las
moléculas celulares,
manteniéndolas en sus lugares
originales e impidiendo su
degradación
Hay dos métodos de fijación con
fijadores líquidos: inmersión y
perfusión.
INMERSION
• Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5
cm de espesor para que el fijador alcance el
interior de la pieza antes de que ésta comience
a deteriorarse. Esto depende de la velocidad de
penetración del fijador y de las características
del tejido, por ejemplo, si tiene cavidades por
donde penetre la solución fijadora.
• El volumen recomendado de fijador debe ser 20
veces superior al volumen de la pieza.
• La osmolaridad entre tejido y solución fijadora
deben estar equilibradas.
• El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico
• El tiempo de fijación depende de cada tipo de
fijador, pero generalmente existe un tiempo
máximo para cada uno de ellos que no debe ser
excedido.
Perfusión
• Por este procedimiento la solución fijadora
se introduce a través del sistema circulatorio
mediante el cual accede a todas las células
del tejido gracias a la red de capilares
• Mediante este método se puede fijar un
animal completo introduciendo la solución
fijadora a través del ventrículo cardiaco, con
lo que el fijador llegará a todas las células
irriegadas por la sangre bombeada por dicho
ventrículo
• Antes de introducir el fijador en el sistema
de vasos sanguíneos hay eliminar
previamente la sangre con una solución de
lavado oxigenada, de otra manera su
interacción con el fijador produce trombos
CLASIFICACION
Los fijadores se clasifican en dos
grandes grupos:
a) Oxidantes: el tetraóxido de osmio
(ácido ósmico), el bicromato de potasio,
ácido crómico, bicloruro de mercurio o
“sublimado corrosivo”, ácido pícrico,
ácido acético.
b) Reductores: el formaldehído, el
glutaraldehído, el alcohol etílico, el
alcohol metílico.
 CUALIDADES QUE DEBE
TENER UN BUEN FIJADOR
 Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes
que aparezcan los fenómenos post-mortem (autólisis,
desintegración, etc.).
 Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación
correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar
 Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que
presentaban in vivo
 Permitir el empleo de los procedimientos necesarios para su
observación ulterior (cortes, coloración, etc.)
 Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la
fijación o después de ella
 No provocar o impedir la producción de estructuras
artificiales
 No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos
quebradizos
 APLICACIÓN DE LOS
FIJADORES
 La acción oxidante o reductora de los fijadores le
confieren a las células ciertas condiciones que
posibilitan una mejor aplicación de las sustancias
colorantes, por ejemplo:
 El alcohol etílico absoluto conserva el glucógeno
 El bicloruro de mercurio provoca que las anilinas
coloreen de manera más brillante a las fibras
colágenas,
 El bicromato de potasio facilita la coloración de las
mitocondrias, el ácido acético permite una mejor
tinción de los núcleos
 El cloruro de calcio conserva e insolubiliza
parcialmente a los lípidos.
ALCOHOL ETILICO (CH3-CH2-OH
• Fija por deshidratación y se usa entre el
70 y 90 %
• Es un buen elemento para preservar
moléculas, como ciertas enzimas,
propiedades antigénicas, glucógeno,
pigmentos y para las extensiones
citológicas
• Debido a que deshidrata, a la vez que fija,
se puede usar también como un
conservante de las muestras
• Tiene inconvenientes como el
endurecimiento y la retracción de los
tejidos
• Carece de efecto mordiente
ACIDO ACETICO
(CH3COOH)
• Su proceso de fijación consiste en
cambiar el estado coloidal de las
proteínas
• Se utiliza a una concentración que
varía entre el 1 y el 5 %
• Es el fijador ideal para ácidos nucleicos
y nucleoproteínas
• Como inconvenientes cabe destacar la
destrucción de las mitocondrias y mala
fijación de membranas y citoplasma.
• Se suele usar en combinación con
otros fijadores
Ácido
pícrico(C6H2OH(NO2)3 )
• La fijación la produce porque sales del tipo
picrato coagulan con las proteínas de los
tejidos.
• Se suele usar el 2 % de una solución saturada
de ácido pícrico.
• Preserva bien la estructura celular, no produce
retracciones cuando el tiempo de fijación es
óptimo, preserva bien glucógeno y lípidos
• Es un buen fijador para tinciones generales
puesto que favorece la unión de los colorantes
• Hay que eliminarlo completamente antes de
proceder a la inclusión en ceras como la
parafina
• Se suele usar combinado con otros fijadores.
 FORMALDEHIDO(CH2=O)
Altamente volátil y muy inflamable
Se obtiene por oxidación catalítica del
alcohol metílico
Las disoluciones acuosas al ≈ 40 % se
conocen con el nombre de formol, que
es un líquido incoloro de olor penetrante
y sofocante
estas disoluciones pueden contener
alcohol metílico como estabilizante.
Otros nombres: Formalina, aldehído
fórmico, óxido de metileno,
metanaldehído, oxometano, formol
FORMALDEHIDO(CH2=O)
 Fue descrito por primera vez en 1859 por el químico
ruso Aleksandr Butlerov (1828–86),2 donde lo llama
"Dioxymethylen" (methylene dioxide)por un error en
su fórmula (C4H4O4). No fue hasta 1869 que August
Wilhelm von Hofmann lo identificó correctamente.
 El formaldehído se disuelve en agua (400 L gas /L de
agua a 20 °C). La disolución se degrada lentamente
bajo formación de paraformaldehído, el polímero del
formaldehído. También puede formarse el trímero
cíclico.
 La oxidación del formaldehído da ácido fórmico y en
una segunda etapa agua y dióxido de carbono.
 Actúa mediante la formación de puentes entre las
moléculas tisulares.
VENTAJAS DEL FORMOL
Tiene un solo componente
(formaldehído) y por ello la fijación única
La imagen microscópica que produce es
el “estándar de oro”, reconocida por
todos los patólogos.
El formol es quizá el único fijador cuyo
mecanismo es conocido en detalle
Es muy barato y abundante
La mayoría de los métodos de tinción se
crearon para tejidos fijados con formol
 DESVENTAJAS DEL
FORMOL
 El cancerígeno con un nivel de toxicidad muy alto
 Es un proceso muy lento y en tres etapas:
penetración (muy rápida) que detiene la autolisis,
la unión covalente que es 12 veces más lenta
que la penetración, y el cruzamiento o “cross-
linking” que es 4 veces más lento que la
formación de la unión covalente
 El cruzamiento (“cross-linking”) completo
requiere un mínimo de 48 horas de fijación
afectando el tiempo de finalización
 Afecta la recuperación del ADN, mARN y la
eficacia de las pruebas moleculares y genéticas
 La neutralización siempre es incompleta
 El reciclaje aumenta la exposición
GLUTARALDEHIDO
 Forma puentes entre las moléculas de los
tejidos
 Se usa a una proporción de entre el 0,5 y el 3 %
 Tiene una alta capacidad para preservar la
estructura celular, por lo que es el fijador de
referencia para observación de ultraestructuras
celulares con el microscopio electrónico
 Se usa en soluciones tamponadas isotónicas
 Se usa tambien como desinfectante de equipos
medicos y como un agente de endurecimiento
en el revelado de los rayos X y en la industria
del cuero se usa como agente curtidor y es un
componente de líquidos de embalsamamiento.
Tetróxido de osmio
Se emplea al 1 % en soluciones
tamponadas.
Es buen fijador de la ultraestructura de la
célula por lo que se emplea habitualmente
para las observaciones con el microscopio
electrónico
Es un buen fijador para grasas y
membranas celulares
Por su fuerte carácter oxidante no se usa
para tinciones convencionales, excepto para
las impregnaciones argénticas como el
método de Golgi.
Mezclas fijadoras
Solución de Bouin
Solución de Carnoy
Glutaraldehido-tetraoxido de osmio
Liquido de Zenker
Liquido de Clarke
Liquido de Helly
Liquido de Karnovsky
Liquido de Lewitzky
Liquido FAA
Solución de Bouin
 Está formado por ácido pícrico, formaldehído
y ácido acético glacial
 Muy utilizado en histología embriológica y
para órganos genitales
 Se recomienda cuando se desea colorear con
cualquier técnica tricrómica para la
diferenciación de tejido muscular y conectivo
 Las muestras se deben lavar con etanol a 70º
 Hay que tener cuidado con el tiempo de
fijación, que no debe exceder de 48 h en el
caso de fijaciones por inmersión
 No está recomendado para el riñón ni para el
estudio de mitocondrias
Solucion de Carnoy
Es un buen fijador para el glucógeno,
para los hidratos de carbono simples y
para las proteínas fibrosas
Es bueno para visualizar los ácidos
nucleicos, aunque no la morfología
nuclear, y para los grumos de Nissl del
sistema nervioso
Está formado por etanol absoluto 60 %,
cloroformo 30 % y ácido acético glacial
10 %.
Tiende a destruir micobacterias.
 Líquido de Zenker
se la puede emplear para la preservación
de componentes ricos en sangre y para la
realización de métodos tricrómicos y
coloración de miofilamentos
En el momento de usar de debe agregar 5
ml de ácido acético glacial por cada 95 ml
de la solución stock.
Esta compuesto por 12.5 g de Cloruro de
mercurio; 6.3 gr de Dicromato de potasio;
2.5 gr de Sulfato de sodio y 250 ml de
agua destilada
OTRAS MEZCLAS UTILES
 Líquido de Karnovsky: se utiliza especialmente
para la fijación de muestras destinadas al estudio
con microscopio electrónico. Es una mezcla de
formaldehido, glutaraldehido y cacodilato de sodio
 Líquido de Helly: Util para médula ósea, tejido
hematopoyéticos y estudios de discos
intercalares. En el momento de usar de debe
agregar 5 ml de formol puro por cada 95 ml de
solución stock
 Líquido de Lillie o B-5: Util para la fijación de
médula ósea, nódulos linfáticos y otros tejidos
hematopoyéticos. En el momento de usar se debe
agregar 5 ml de formol puro por cada 50 ml de
solución stock.. Formado por cloruro de mercurio,
acetato de sodio y agua destilada
 OTRAS MEZCLAS UTILES
 Líquido FAA: utilizada por los botánicos para la
fijación de muestras vegetales. La concentración
de alcohol es mayor debido a que los vegetales
presentan gran cantidad de carbohidratos en su
composición macromolecular (celulosa y
hemicelulosa). Esta compuesto por : Etanol al 50%
67 ml; Acido acético glacial 17 ml; Formaldehído
puro 16 ml
 Líquido Anatech Ltd. o Formol-zinc: Esta
mezcla no tamponada es un excelente fijador para
inmunohistoquímica. La solución tamponada se
prepara agregando 1.6 gr de cloruro de zinc a
1000 ml de Formol-PBS pH 7,2. Contiene 100 ml
de Formaldehído ,4.5 gr de cloruro de sodio, 1.6 gr
de sulfato de Zn y 900 ml de agua destilada