Técnica Histológica

• Es el conjunto de procedimientos y
manipulaciones necesarias que tiene
por objeto transformar el tejido
orgánico en laminas delgadas para su
examen microscópico.
• Por lo que resultan ser objetos frágiles y
vulnerables.
• Requiere de un minucioso proceso de
elaboración.
• Se la realiza siguiendo pasos
secuenciales
• La observación de la muestra se la
realiza por transparencia y se requieren
cortes muy finos de 5 a 8 um
• Permite conservar las estructuras
orgánicas mediante substancias
químicas
• Mantiene inalterable su estructura a
través del tiempo.
 METODOS DE LA TECNICA HISTOLOGICA

• Técnica de
Inclusión en
parafina.
• Técnica de
inclusión en
celoidina.
• Método de
congelación.
 Pasos de la técnica histológica en la
inclusión en Parafina
1.OBTENCIÓN DE MUESTRAS
2.FIJACION
3.LAVADO
4.DESHIDRATACIÓN
5. ACLARAMIENTO
6.PREINCLUSION
7.INCLUSIÓN
8.CORTE SECCION
9.TINCIÓN DE LOS CORTES
10. MONTAJE y OBSERVACION
 1. OBTENCION DE LA MUESTRA
Es la toma de muestra
de un pequeño
fragmento de tejido o
bloque
El material a utilizar
puede ser extraído de
animales de
experimentación de
laboratorio, o bien
puede tratarse de
material humano.
 VARIANTES DE LA TOMA DE MUESTRA
• Puede provenir de
tres fuentes: Las
necropsias, las
biopsias y las
piezas operadas.
BIOPSIA
Se toma un fragmento
de tejido que se
obtienen de un sujeto
con vida con el objeto
de estudiarlos al
microscopio con fines
de diagnóstico
histopatológico o de
tratamiento.
Tipos de Biopsia
PIEZAS OPERADAS
Los tejidos que han
sido extraídos de las
intervenciones
quirúrgicas,
generalmente tumores
u órganos inflamados,
también pueden
darnos material de
investigación.
AUTOPSIA O NECROPSIA

• Son las piezas

que se obtienen
de un cadáver.
• para determinar
causas de muerte
CITOLOGIA EXFOLIATIVA
Es u n recurso de diagnostico.
El estudio de Se basa en los
cambios que suceden en las células
aisladas o que se desprenden o
exfolian de las células epiteliales
superficiales que se descaman
como la mucosa bucal, respiratoria,
urinaria vaginal.
Detecta alteraciones en la
estructura celular que permiten
establecer diagnostico de lesiones
pre malignas
FROTIS O IMPRONTAS
• Es el estudio de las
capas delgadas de
líquidos orgánicos
como sangre,
exudados etc.
DATOS DE LA PIEZA

Se debe obtener
toda la información
posible del
material a
procesar.
2. FIJACION
• Este proceso se refiere al
tratamiento del tejido con
sustancias químicas fijadoras que
tienen varias finalidades
• Conservar los tejidos de forma que
muestren el mayor parecido posible
a su estado in vivo.
• Detiene o interrumpe en forma
rápida los procesos celulares de
autolisis que ocurren después de la
muerte
• Aumentar la dureza del tejido para
facilitar la preparación de finas
películas de éste.
• Destruir bacterias y gérmenes que
pudieran encontrarse en ellos
 Poderes de los fijadores
• La mayor parte de los
fijadores actúan como
oxidantes, favoreciendo así
la coloración ulterior de los
tejidos.
• Un buen fijador debe ser
de acción instantánea, de
bajo costo, fácilmente
manipulable y tener
poderes o capacidades
como:
1.P. Coagulación
de proteínas.
2.P. Conservación
3.P. Bactericida
4.P. Penetración
5.P.
Insolubilización
6.P. Mordiente
FIJADORES QUIMICOS
Son los más utilizados, • NOTA:
pueden ser: La fijación mantiene las
1. Fijadores simples, estructuras al estimular la
constituidos por una sola formación de enlaces cruzados
entre las proteínas.
sustancia química
2. Fijadores compuestos o • La mejor fijación es cuando a
mezclas fijadoras cuando pasado el menor tiempo entre
varias sustancias la muerte del tejido y la fijación.
intervienen en su
constitución. • El tamaño de la muestra debe
de ser de 2-3 cm. variando el
estudio para lo cual de va a
utilizar.
 FIJADORES
• Formol al 10%, es el más usado.
Su empleo es aconsejable en
todos los casos en que no se
disponga de un fijador especial,
principalmente cuando se trata
de fijar órganos o tejidos para
estudios histológicos tiene
ventajas, no precipitan proteínas
y no contrae estructuras, fija
rápidamente, gran poder de
penetración, mordiente
bactericida, bajo costo, fácil
manejo
• b) Alcohol etílico absoluto o de
96%, se usa generalmente en
microquímica.
• c) Alcohol metílico, se lo emplea
con frecuencia para fijar frotis
desecados (sangre, médula ósea,
ganglio, bazo, líquidos de
punción, etc.)
• d)Agentes oxidantes ( En ME,
Glutaraldehido Permanganato de
K, Tetraoxido de osmio,
precipitan proteínas y tóxico por
sus vapores).
• e)Picratos (precipitan proteína, ej
acido pícrico)
 FIJADORES COMPUESTOS
• 1.Liquido de Bowin ( Formalina,
• Para reunir las acido picrico, acido acetico) mezcla
condiciones picro-formos-acética preserva
deseadas se usan nucleo y bacterias
en su composición • 2.Liquido de Zenker ( formalina,
bicromato de K, bicloruro de Hg)
mezclas de un para epitelio y embriones.
número variable • 3. Líquido de Helly. mezcla Zenker-
de fijadores formol
simples • 4 Líquido de Fleming, mezcla cromo-
racionalmente osmio-acética
• 5.Liquido de Duboscq-Brasil, o
elegidos con el fin Bouin alcohólico.
de completar la • 6.Decalcificacion. Para tejidos duros,
acción de cada uno disuelve la sustancia fundamental
de ellos o atenuar calcificada como el liquido de
Jenkins. *
sus defectos.
3. LAVADO
• Elimina los restos de la
sustancia fijadora para
que la preparación no
se precipite y no forme
manchas .
• Se realiza con agua
destilada o corriente
• El tiempo depende del
tamaño de la muestra.
 4. DESHIDRATACION
• Después que la muestra ha sido fijada se
elimina el fijador y se deshidrata.

• Debido a que una gran parte del tejido está

constituida por agua, se aplica una serie
gradual de soluciones acuosas de menor a
mayor de agente deshidratante, por ejemplo,
Alcohol Etílico o Acetona.

• Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una

solución de 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y
alcanzando de manera paulatina el alcohol al
100 % para eliminar el agua.

• Esto se hace por que si se colocara el tejido en

una solución al 100% de alcohol
inmediatamente, el agua saldría muy rápido
del tejido y se deformaría además sirve para
remover impurezas, reemplazar el agua por
alcohol que es mas soluble a la parafina
5.ACLARACION O DIAFANIZACION

• Se somete al tejido a la acción de un

solvente o una sustancia soluble tanto al
alcohol como con el medio de inclusión a
utilizar como la Parafina líquida.
• Se llama aclaramiento ya que el tejido se
torna transparente o claro esto se debe a
que cambia su índice de refracción.
• La sustancia comúnmente utilizada es el
Xileno o Xilol, también se pueden utilizar
Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios
de aclaramiento.
• El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de
la célula.
NOTA:
• Se realizan 3 recambios 1h ½ cada uno
 6. PREINCLUSIÓN o IMPREGNACION
• Por lo general se coloca la
muestra de tejido en un
recipiente y se le agrega la
parafina diluida colocando la
muestra en una estufa
histológica a una Tº 56 a 58
grados de 30 minutos a 6
horas. Objetivo de la pre
inclusión: Evapora el xilol,
facilitando el ingreso de la
parafina a los intersticios
• NOTA: Se realizan 3 recambios
de 1 hora cada uno
 NOTA: Los siguientes pasos T.
Histológica
Tienen el fin de que se puedan obtener cortes suficientemente
finos para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser
incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme. Las
sustancias usadas para este fin son: gelatina o parafina.
El objeto de la inclusión es:
• Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.
• La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier
medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el
medio de aclaramiento y penetra en el tejido.
7. INCLUSION
• Debido al calor, el Xilol se evapora
y los espacios anteriormente
ocupados por ellos son ahora
ocupados por la parafina.
• El tejido es incluido en un molde
de papel o metal ( LEUKART) de
forma rectangular donde se vierte
parafina liquida que penetra en los
vasos, en los espacios intercelulares
y también en el interior de las
células embebiendo el tejido se
deja solidificar a temperatura
ambiente, formándose un bloque
sólido de parafina que se le
denomina TACO haciendo más
fácil la obtención de cortes con el
micrótomo.
 CONFECCIÓN
DEL TACO
8. CORTE
• El taco se corta en secciones
lo suficientemente delgadas
como para permitir el paso de
la luz.

• La mayor parte de los

preparados para microscopia
óptica tienen un grosor entre
3 a 10 micrómetros.

• Para estos cortes se utiliza un

aparato llamado
MICRÓTOMO.
MICROTOMO DE MINOT
• Llamado también
Rotativo.
• Consta de un sistema
de avance mecánico
integrado a una
manivela, Platina móvil
donde se coloca el taco,
una cuchilla fija y
aguda.
 ULTRAMICROTOMO
• Para Microscopia
Electrónica se requieren
cortes más delgados
(denominados ultra finos)
de aproximadamente 25 a
100 nm. de espesor y de
0.5 mm. de lado medio.
Para esto se utiliza un
MICROTOMO CON HOJA
DE VIDRIO O DIAMANTE.
Una vez preparados, se
montan sobre rejillas de
cobre con un diámetro de
3mm.
CRIOSTATO
• Cuando deseamos estudiar grasas o
lípidos que se extraen en el proceso de
aclaramiento o enzimas que quedan
inactivadas por el calentamiento de la
inclusión, usamos la Técnica de
Congelación de Tejidos.
• Un tejido congelado, es los
suficientemente duro para ser cortado.
• Se sumerge la muestra de tejido en
Nitrógeno líquido para tener una
congelación rápida.
• Luego se corta con un aparato especial
denominado CRIOSTATO.
• La ventaja de esta técnica es que los
cortes que se obtienen son muy rápidos,
se puede utilizar en el diagnostico de
material patológico, tomado en
intervenciones quirúrgicas y el resultado
se obtiene en el transcurso de una
operación.
EXTENSION

• Los cortes se hacen flotar

en baño maría.

• Se utilizan portaobjetos
limpios y preparados con
un adhesivo adecuado.
Ej. Albumina de huevo

• El preparado debe
quedar bien extendido y
sin pliegues
EXTENSIÓN

• Luego de escurrir
el exceso de agua
llevar a estufa (57
°C) por 30 min
• Identificar
9. TINCIÓN
• La mayoría de los tejidos son
resultan incoloros.
• La tinción es el conjunto de
procedimientos para dar
características cromáticas a la
morfología y estructura de la
célula a través de la
coloración.
COLORANTES
• Un colorante es toda
sustancia química que
tenga capacidad de dar
coloración a otra sustancia.
• Las tinciones son
combinaciones de
colorantes ácidos y básicos
que permiten obtener
suficiente contraste de
color en los cortes
histológicos comunes
 COLORANTES
• Los colorantes pueden agruparse
en tres clases principales:
• Colorantes que diferencian los
componentes básicos y ácidos de la
célula (hematoxilina y eosina).

• Colorantes especializados que

distinguen los componentes
fibrosos de la matriz extracelular.

• Sales metálicas que se precipitan

en los tejidos y forman depósitos
de metales en ellos.
TINCION UNIVERSAL
Llamada también
tinción universal.
Se usa para todo
tipo de tejido como
examen de rutina,
es bicromica.
8.TINCIÓN DE LOS CORTES

La reacción de los grupos aniónicos con un

colorante básico se denomina BASOFILIA
(que tiene afinidad por lo básico)

La reacción de los grupos catiónicos con un

colorante ácido se denomina ACIDOFILIA o
EOSINOFILIA
(que tiene afinidad por lo ácido)
Coloración con Coloración con Coloración
Hematoxilina Eosina Hematoxilina-Eosina
Basófilo
(azul)

Acidófilo
(rosado)
BATERIA DE TINCION UNIVERSAL
 OTRAS COLORACIONES
Tricrómico de Van
Coloración Hematoxilina-
Gieson.
Eosina
Resultados:
Resultados:
Células:
Núcleos y material basófilo
- Núcleos: negro - azul
en tonos de morado.
- Citoplasma: amarillo
Citoplasma en tonos de
rosado
Colágeno: rojo intenso
Glándula salival
Piel humana, objetivo
Sublingual, objetivo 40X
40X

Impregnación Argéntica
Resultados:
Célula (neurona):
-Soma y prolongaciones
(dendritas, axón) de
color pardo oscuro

Corteza cerebral de rata,

objetivo 40X
Ácido Periódico de Schiff (PAS)
Hematoxilina
Resultados:
- Núcleos: azul
-Células caliciformes y Chapa estriada en
fucsia

Intestino delgado, objetivo 40X

Corte de piel con tricrómico de Masson

10. MONTAJE
Para conservar la lamina y
protegerla
Finalmente, cubrimos los
"portaobjetos " con una
delgada lámina de vidrio
(cubreobjetos) en la cual
colocamos una gota de
bálsamo de Canadá o resina
sintética en la preparación El
cubreobjetos se pega por
capilaridad
Quedando lista para su
observación en el microscopio.
Artefactos
• Los artefactos no son
alteraciones que el
tejido sufrió en vida,
sino posteriores debidas
a la manipulación
humana al preparar los
cortes imprecisamente.
Tenemos entonces que un
artefacto es una
alteración no natural del
tejido generada
artificialmente durante su
preparación.
PLIEGUES Y ARRUGAS
Se producen por sobre
posiciones de tejido,
debido a la extrema
delgadez del corte no se
pueden extender sin
lesionarlo. Generalmente
ocurren durante el paso 7
dela técnica de la parafina
BURBUJAS
Se generan al colocar el
cubreobjetos sobre el tejido
–paso 10 de la técnica dela
parafina- quedando
espacios de aire entre éste y
el portaobjetos. Al
microscopio se observan
generalmente como
espacios ocupados por
aire, circulares,
transparentes, de bordes
generalmente regulares en
forma de una línea negra
RETRACCION
Son porciones de tejido
separadas entre sí
artificialmente, generando
espacios y cambios en la
estructura tisular que in vivo no
existen. Las diferentes sustancias
químicas a las que los tejidos son
sometidos ocasionando
deshidratación o la excesiva
temperatura de la parafina
fundida -durante los pasos 4 y 5
de la técnica- son las causantes
más comunes. Se observan como
interrupciones o espacios
sinuosos en el tejido, de bordes
irregulares.
MUESCAS DE LA CUCHILLAS
Son interrupciones de la
continuidad del tejido
causados por defectos en el
filo de la cuchilla del
micrótomo. Éstos ocurren
durante el paso 6 de la
técnica cuando la cuchilla
está mal afilada o hay una
muesca o melladura en el
filo de ella, marcando una
huella recta, de bordes
regulares que va de un lado
a otro del corte.
CUERPO EXTRAÑO
Son partículas ajenas al tejido
atrapadas bajo el cubreobjetos
durante el proceso de
preparación del tejido. Se
observan al microscopio como
estructuras deforma variable,
generalmente fuera del plano
del tejido en observación, ya sea
por encima o por debajo de él -
esto último lo puede detectar al
modificar finamente el enfoque
de la imagen con el tornillo
micrométrico, mostrando la
diferencia en la nitidez de la
imagen del tejido y del cuerpo
extraño.
Histoquímica
• Es un método especifico.
• Se utiliza para localizar determinadas
sustancias especificas .
• Se depositan reactivos o colorantes
en regiones del tejido que reaccionan
con componentes celulares para ser
identificados
• Como los lípidos se preparan
mediante congelación, se cortan con
criostato y se sumergen en colorantes
liposolubles como el sudan III o sudan
negro.
• Ácidos nucleicos se identifican con la
reacción fulgen.
• Los proteoglicanos se observan con
PAS
INMUNOHISTOQUIMICA

• Los anticuerpos producidos

por el organismo dirigidos
contra moléculas
especificas o proteínas
extrañas no ayudan a
detectar se presencia en las
células
• Se utilizan moléculas de
colorantes fluorescentes
que se ligan a los
anticuerpos.
• Se observan con el MUV.
 FRACCIONAMIENTO CELULAR

• Esta técnica permite

romper las célula
enteras de manera
controlada.
• Se consigue
centrifugando a alta
velocidad.
• Las células rotas dejan
libres sus organelas
AUTORRADIOGRAFIA
• Consiste en incubar las células
en presencia de determinados
isotopos radiactivos que se
incorporan a determinadas
moléculas. Estos radioisótopos
son inestable y emiten
radiaciones ionizantes que se
pueden registrar con aparatos o
mediante impresión en una
película Es u método útil para
localizar e investigar una
secuencia temporal especifica
de fenómenos
 CITOLOGIA EXFOLIATIVA
• Método para el estudio de
cáncer en cuello uterino
• Se obtiene muestra de la
mucosa del cuello uterino se
realiza un frotis.
• Se fija con alcohol éter.
• Se tiñe con tinción de
Papanicolaou.
• Los núcleos de las células se
tiñen de morado por la
hematoxilina .
• El citoplasma varia de naranja
( Orange G) a rosado( EA50)
• Se distinguen células
intermedias, superficiales ,
basales y naviculares
FROTIS