PREGUNTAS HISTOTECNOLOGÍA

1. ¿Qué es la fijación de tejidos y para qué se utiliza?

2. ¿Cuál es la función del formol como fijador?
3. ¿Qué problemas puede causar el ácido pícrico como fijador?
4. ¿Cuál es el propósito de la deshidratación de tejidos con alcoholes
crecientes?
5. ¿Qué es el aclaramiento de una muestra y cómo se realiza?
6. ¿Por qué se utiliza la inclusión en parafina en el procesamiento histológico de
una muestra?
7. ¿Qué es el micrótomo y cómo se utiliza en el corte de una muestra?

1. La fijación de tejidos es una técnica utilizada para la preservación de los tejidos en un

estado lo más similar o parecido posible al aspecto que tenían en vida. Busca evitar la
autolisis, ya que esta provoca la ruptura de las células y por tanto la liberación de enzimas
que dañan al tejido, también buscan evitar la invasión de microorganismos (Como bacterias
u hongos) y la evaporación de ciertos componentes.

La fijación de tejidos se utiliza precisamente para preservar la estructura celular y la

composición química de los tejidos después de la extracción de una muestra, lo que
permite su posterior procesamiento histológico y estudio. También es cierto que la
fijación ayuda a evitar la autolisis y la invasión de microorganismos, y a mantener la
integridad del tejido para que pueda ser analizado con mayor precisión.

2. El formol cómo fijador, se une a la muestra (Ya que es un fijador aditivo), en sitios
específicos de las proteínas, formando una malla con las mismas (proteína-formol-proteína),
que le da al tejido la capacidad de mantenerse en un aspecto similar al vital y un estado gel,
por la insolubilización de las mismas proteínas. Más no las coagula ni las precipita.

El formol es un fijador aditivo que reacciona con los grupos amino de las proteínas,
formando enlaces covalentes que cruzan las proteínas y las hacen más resistentes a
la degradación. Esto permite que el tejido se mantenga en un estado similar al vital y
se preserve su estructura y composición química. Además, es cierto que el formol no
coagula ni precipita las proteínas, sino que las insolubiliza.

3. El ácido pícrico es un fijador por formación de sales, que se une a las proteínas formando
compuestos iónicos, de naturaleza salinógena e insolubles, liberando agua en el proceso. El
ácido pícrico puede generar algunos problemas cómo: Retraer excesivamente el tejido por su
ph ácido si se lo deja mucho tiempo (ácido débil), teñirlo de amarillo (Si es el caso se debe de
lavar con alcohol 70°) o incluso si se acerca a fuentes de calor, puede explotar ya que es un
compuesto utilizado en la fabricación de dinamita. También tiene acción descalcificadora.

El ácido pícrico es un fijador que forma sales iónicas con las proteínas, lo que hace
que las proteínas sean insolubles y más resistentes a la degradación. Sin embargo, a
diferencia del formol, el ácido pícrico no forma enlaces covalentes cruzados entre las
proteínas, lo que hace que el tejido sea menos estable a largo plazo.
También es cierto que el ácido pícrico puede tener algunos problemas, como el
potencial de retraer excesivamente el tejido por su pH ácido si se lo deja por mucho
tiempo, lo que puede afectar la interpretación histológica. El ácido pícrico también
puede teñir el tejido de amarillo, pero esto puede solucionarse mediante un lavado
adecuado con alcohol. Es importante tener en cuenta que el ácido pícrico es un
compuesto peligroso que puede explotar si se expone a fuentes de calor, por lo que
se debe manipular con cuidado. También es cierto que tiene acción decalcificadora,
lo que lo hace útil para el procesamiento de muestras óseas.

4. El propósito de la deshidratación con alcoholes crecientes es buscar quitar el agua de los

tejidos, de manera progresiva para no dañar el tejido y así hacer al mismo miscible en
parafina, ya que buscamos embeber o incluir el tejido en la misma y esta es no polar, a
diferencia del agua que es polar. No son compatibles.

La deshidratación con alcoholes crecientes es un paso importante en el

procesamiento histológico, ya que busca eliminar el agua del tejido de manera
progresiva para evitar dañarlo y permitir su inclusión en parafina. La parafina es no
polar, mientras que el agua es polar, lo que hace que no sean compatibles. Por lo
tanto, la deshidratación con alcoholes crecientes busca hacer el tejido miscible en
parafina, lo que facilita su inclusión y posterior corte en el micrótomo.

5. El aclaramiento de la muestra busca quitar el alcohol de la muestra ya que este tampoco es

miscible con la parafina, pero es la manera más eficiente de quitar el agua. Así quitamos el
alcohol, con ayuda de 2 posibles soluciones: el XILOL y el CLOROFORMO. Ambos funcionan
pero son utilizados en situaciones diferentes, el xilol es más barato, menos tóxico pero no se le
puede dejar el tejido mucho tiempo porque lo daña, así que se usa para el procesamiento de
tejidos en un corto período de tiempo. Tejidos que no necesitan mucho tiempo para
procesarlos. En cambio el cloroformo es caro, es más tóxico pero es un reactivo de espera, lo
que significa que si sellamos bien el frasco con la muestra para evitar que se evapore,
podemos dejar dicha muestra mucho tiempo en el reactivo. A la muestra se le realizarán de 1
a 3 baños en estos reactivos dependiendo del tamaño y composición de la misma.

El aclaramiento de la muestra busca quitar los alcoholes utilizados en el proceso de

deshidratación, ya que estos no son miscibles en parafina y pueden interferir en la
inclusión del tejido. Para esto se utilizan agentes de aclaramiento como el xilol o el
cloroformo.

El xilol es un agente de aclaramiento comúnmente utilizado en histología. Es más

económico y menos tóxico que el cloroformo, pero también es menos efectivo y más
propenso a dañar el tejido si se deja demasiado tiempo. Por lo tanto, se utiliza
principalmente en el procesamiento de muestras de tejidos que no necesitan mucho
tiempo de procesamiento.

Por otro lado, el cloroformo es más caro y más tóxico que el xilol, pero también es
más efectivo como agente de aclaramiento. Además, tiene la ventaja de ser un
reactivo de espera, lo que significa que se puede dejar la muestra en el cloroformo
por períodos prolongados de tiempo sin dañarla, siempre y cuando el frasco que la
contiene esté bien sellado para evitar la evaporación del cloroformo.

En cuanto al número de baños necesarios para la aclaramiento, esto dependerá del

tamaño y la composición de la muestra. Por lo general, se realizan de 1 a 3 baños en
el agente de aclaramiento.

6. La parafina se utiliza ya que es un medio neutro y consistente, el cuál podemos utilizar

para cortar el tejido micrométricamente sin dañarlo. Se busca hallar un medio que resista el
corte, no dañe el tejido y no cambie su composición. Además su punto de fusión no es tan alto
(56 a 60 grados celsius) lo que nos evita trabajar con temperaturas muy altas y se seca a
temperatura ambiente. Podemos usar cera de abeja para agregarle consistencia y que no se
desgrane, a una parafina de baja calidad.

La parafina es una sustancia que se utiliza en la inclusión del tejido ya que es un

medio inerte y fácil de manipular, además de que posee una consistencia que facilita
el corte con el micrótomo. También es cierto que su punto de fusión es relativamente
bajo, lo que hace que sea fácil de trabajar con ella sin necesidad de altas
temperaturas, y se seca a temperatura ambiente. En cuanto a la cera de abejas, esta
puede utilizarse para agregar consistencia a la parafina de baja calidad, pero también
se pueden utilizar otros aditivos como resinas o plásticos para mejorar sus
propiedades.

7. El micrótomo es una herramienta utilizada en el laboratorio para la realización de cortes

micrométricos que permitan el pasaje de luz a través de la muestra y así su posterior
observación en el microscopio. Hay de muchos tipos: Deslizamiento, congelación por CO2 o
N2, en criostato, de balanceo y de rotación o tipo Minot. Es este último el que utilizaremos en
la rutina, ya que nos permite realizar cortes seriados de la muestra. Así este tiene una
cuchilla fija y un porta-bloques móvil, lo que permite el deslizamiento del bloque sobre la
cuchilla y así esta pueda cortar el mismo. Primero se desgasta el bloque hasta llegar a la
muestra y luego hacemos los cortes con la palanca o tornillo de deslizamiento. Una vez
realizado el corte, se pasa la cinta al baño de flotación a 30 grados celsius aproximadamente
y luego con la lámina se lo retira una vez liso. En este momento se envía a una estufa (60/70°)
o a la plancha. El calor de estas hará que las proteínas de la muestra coagulan y se fijen bien
al vidrio de la lámina.

Me gustaría agregar que la elección del tipo de micrótomo dependerá de la naturaleza

de la muestra y del objetivo del estudio. Por ejemplo, si se desea estudiar la
distribución de lípidos en una muestra de tejido adiposo, se podría utilizar un
micrótomo de congelación que permita obtener secciones más frescas y evitar la
alteración de la composición lipídica de la muestra. Además, también es importante
mencionar que la técnica de la preparación de las muestras para su corte en el
micrótomo es crucial para obtener cortes de buena calidad y evitar artefactos que
puedan afectar la interpretación de los resultados.
 DESCALCIFICACIÓN
¿Qué es la calcificación en los tejidos y por qué es necesario realizar la descalcificación?
La calcificación en los tejidos refiere a la presencia de Calcio dentro de los mismos. Esto puede
ser por causas normales como el tejido óseo o patológicas como la calcificación de tejido
mamario, cartilaginoso o piel. Se precisa descalcificar por la dificultad que la presencia de
calcio en los tejidos presenta para el corte y procesamiento de los tejidos, pues le agrega
mucha RIGIDEZ.
La calcificación en los tejidos se produce cuando los depósitos de calcio se acumulan en los
tejidos blandos del cuerpo, como los músculos, las arterias y los tejidos mamarios. Como
mencionaste, esto puede ser normal en el tejido óseo, pero también puede ser un signo de
enfermedad en otros tejidos. La presencia de calcio puede endurecer y hacer que los tejidos
sean más rígidos, lo que dificulta el procesamiento y corte de los mismos para su examen
histológico. Por lo tanto, se puede utilizar un proceso de descalcificación para eliminar el
calcio y hacer que los tejidos sean más blandos y manejables para su procesamiento.

1. ¿Cuáles son los dos métodos principales de descalcificación?

Los métodos principales son la descalcificación a través de ácidos (débiles y fuertes) y a través
de agentes quelantes.

2. ¿Cuáles son los descalcificantes ácidos fuertes y cuáles son los

descalcificantes ácidos débiles?
Los descalcificantes ácidos fuertes son el ácido clorhídrico y el ácido nítrico, se disocian
totalmente en solución, bajan demasiado el ph y actúan muy rápido, recomendados para
tejido óseo compacto o tejido muy calcificado. Los ácidos débiles son ÁCIDO PÍCRICO, Acético y
Fórmico, siendo los dos primeros fijadores, actúan de manera menos intensa. Son estos dos los
utilizados en rutina.

3. ¿Cuáles son algunos de los efectos adversos de los ácidos en la

descalcificación?
Los efectos adversos del ácido pueden ser la maceración del tejido, la inutilización del tejido
para inmunohistoquímica, la hidrólisis de ácidos nucleicos y en el caso del ácido pícrico, la
tinción del tejido de amarillo.

4. ¿Qué son los agentes quelantes?

Los agentes quelantes son descalcificantes que atrapan al calcio en el centro de la molécula,
ya que este tiene gran afinidad con dicha molécula. Al agregar este agente, el Calcio al ver
que estará más estable con el mismo (Todos los átomos tienden a la estabilidad energética),
se unirá a este formando quelatos y abandonando el tejido. El problema principal es que
aunque permiten la IHQ y no hidrolizan AN, son de muy lenta acción. Podemos acelerar la
descalcificación con Resinas de intercambio iónico (Aumentan la solubilidad del
calcio intercambiando un ión de su estructura por uno de Calcio, haciendo esto
bajan la concentración de calcio en el medio y así aumentan la solubilidad). Otro
medio para acelerar el proceso son aumentar la temperatura, tener una correcta
relación de volúmenes, agitar, tener una correcta concentración del reactivo
descalcificante y también podemos empapar una gasa del reactivo descalcificante y
tapar la muestra con esta, asegurándonos de que la tape.

5. ¿Qué compuesto se utiliza como agente quelante en la descalcificación?

El EDTA o ácido etilendiaminotetracético.

6. ¿Cuáles son los beneficios de los agentes quelantes en la descalcificación?

Conservan mejor los tejidos, nos permiten la realización de técnicas de IHQ.

7. ¿Cuáles son los factores que influyen en el rango de descalcificación?

*ya mencionados.
 COLORACIÓN
COLOR: Es una propiedad de la luz que somos capaces de percibir con nuestros ojos, la
luz blanca incide sobre un objeto y este absorbe parte de ella, la luz que no absorbe es la
que emite y nosotros captamos, la capacidad de absorber o no luz, está directamente
relacionada con la movilidad electrónica y la cantidad de grupos insaturados de la molécula.
Nosotros percibimos un espectro muy reducido de la luz, desde la luz ultravioleta hasta la
infrarroja. Debemos teñir o colorear las estructuras para poder diferenciarlas, ya que suelen
verse transparentes y además tienen un índice de refracción de la luz muy similar.

1. ¿Cuál es la definición de colorante y de qué está compuesto?

Un colorante es un compuesto coloreado capaz de transmitirle color a un objeto o estructura
con la que entra en contacto. Está compuesto por un cromógeno y un auxocromo, el
cromógeno está conformado por un grupo cromóforo (Grupo insaturado que le aporta color a
la molécula con la que se une, se dice que “soporta” el color, ya que es el que capta la energía
en forma de luz) y un grupo aromático, que presenta electrones móviles, excitables por la
energía lumínica.

2. ¿Qué son los auxocromos y cuál es su función en la molécula del colorante?

Los auxocromos son grupos de naturaleza salinógena, solubles en solventes polares que al
adicionarse al colorante aumentan su capacidad para colorear, esto significa que por sí solos
no tienen efecto colorante. Aumentan la capacidad del colorante al hacerlo soluble.
Si quisiéramos que el colorante fuera soluble en solventes orgánicos, utilizamos un
diferenciador.
Esto significa que los colorantes solo serán solubles en agua o solventes orgánicos
como el alcohol, por tanto NO SERÁN MISCIBLES CON LA PARAFINA y por ello hay que
desparafinar.

3. ¿Qué factores influyen en la unión de un colorante a las diferentes uniones

tisulares?
- Enlaces e interacciones moleculares que sean capaces de establecer
- Grupos funcionales de ambos
- Tamaño y Polaridad
- Solvente en el que se realice la tinción

4. ¿Cuáles son las clasificaciones de los colorantes según su grupo auxocromo

y según el color que transmiten?
Clasificación según su grupo auxocromo: puede ser catiónico (Componente catiónico
coloreado, aportan carga positiva a la molécula, básicos), aniónico (Componente aniónico
coloreado, aportan carga negativa a la molécula, ácidos), componentes neutros (Componente
catiónico y aniónico coloreados) e indiferentes (no forman sales).
Clasificación según el color que transmiten: Pueden ser ORTOcromáticos (Transmiten su
color) y METAcromáticos (Transmiten otro color).
 5. ¿Cuál es la diferencia entre las coloraciones directas e indirectas?
Las colocaciones directas se realizan sobre la muestra con el colorante sin ningún
intermediario que la facilite, ya que hay una afinidad real entre ambas partes. Una
coloración indirecta es aquella en la que se necesita de un intermediario que oficie como
conector de ambas sustancias, y así hacerlas “compatibles” y finalmente unirlas, este
intermediario es el MORDIENTE.

6. ¿Qué es un mordiente y cómo se utiliza en la coloración?

Un mordiente es un intermediario capaz de unir dos componentes que antes se rechazaban,
estableciendo un enlace coordinado entre los 3: Tejido-MORDIENTE-Colorante.
Actúan antes, luego o junto formando una laca.
UN FIJADOR MORDIENTE ES EL ÁCIDO PÍCRICO.

7. ¿Qué es la diferenciación y para qué se utiliza en la coloración?

La diferenciación es un procedimiento o técnica realizada con un agente llamado
diferenciador, que actúa luego de una coloración regresiva, cuya finalidad es remover el
colorante hasta evidenciar una estructura en específico.

8. ¿Qué son las coloraciones IHQ y en qué se basan?

Las coloraciones de IHQ se basan en la utilización de anticuerpos para evidenciar
estructuras, al unirse a las mismas.

9. ¿Qué son las impregnaciones y cómo se utilizan en la coloración?

Se utilizan sales de distintos metales (Como plata u oro) para evidenciar estructuras.
 PIGMENTO FORMÓLICO
1. ¿Qué es el pigmento Formolico y dónde se encuentra?
El pigmento formólico es un residuo marrón negruzco formado por una larga fijación
de un tejido en formol que se ha acidificado, son más propensos a generarlo los
tejidos más sanguinolentos. PIGMENTO ARTEFACTUAL EXÓGENO.

2. ¿Cómo se adquiere el pigmento Formolico?

El pigmento formólico se adquiere por la evaporación de agua de la solución y la consecuente
formación tanto de paraformaldehído como de ácido fórmico, al utilizarlo por mucho tiempo.
En Formaldehído 4% o Formol Puro 10% NO BUFFERADO.

3. ¿Cómo se presenta el pigmento Formolico y cómo se puede eliminar?

Lo podemos observar como puntos negros al microscopio. Se puede eliminar
utilizando:
- NaOH al 1% por 10 minutos luego de desparafinar e hidratar hasta alcohol 96°
- Lavar con H2O corriente

4. ¿Cómo se puede evitar la formación del pigmento Formolico durante la

fijación?
Se puede utilizar usando soluciones buffer junto con el formol, deben tener el pka por encima
del ph 2.5.