H2 Luis Daniel Cruz Martínez

Conjunto de procedimientos aplicados a un material

biológico (animal o vegetal) con la finalidad de
prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para
poder observar, examinar y analizar sus componentes
morfológicos a través de los microscopios fotónicos y
electrónicos.
 objetivos
01
Producir cortes
suficientemente delgados
con lamejor preservación
morfológica posible
03
Permitir que se estudien en
un solo corte la mayor parte
de las estructuras celulares y
tisulares
02
Conservar las características
biológicas y químicas de las
células ytejidos
04
Conocer la correlación
entre la morfología y la
función de las
estructuras celulares y
tisulares
Técnica Técnica
histológica histológica
especial
ordinaria…
Tinción con
hematoxilina
Inclusión en y eosina
parafina
Fijación en
formol al
10%

Si la técnica utilizada no
utiliza con alguno de estos
requisitos entonces es:
Toma de la muestra

Fijación

Inclusión

Microtomía

Coloración o tinción

Montaje
Si proviene de un individuo vivo recibe el nombre de biopsia, que puede ser:
• Incisional: se extrae un trozo de tejido de una lesión o masa.
• Escisional: se extrae toda la lesión o masa.
Cuando la toma de la muestra es de un
Puede tomarse por: cadáver se trata de una necropsia.

Corte (bisturí) Punción Sacabocado

Raspado/
aspiración
legrado
 Esta parte del proceso evitará las modificaciones que ocurren después de
obtener el tejido e impedirá lo que se conoce como cambios post mortem.

Acciones de los fijadores:

• Evita la autólisis (autodigestión)

• Impide alteraciones osmóticas en membrana
• Actúa como antimicótico y antiséptico
• Produce cambios de refracción
• Evita la presencia de artefactos
• Mordente (facilita la entrada de colorantes a los tejidos)

Hay fijadores físicos (calor y congelación) y químicos, que son

aquellos que forman enlaces químicos con moléculas del tejido.
Características de un buen fijador:
Formol al 10%
• No debe disolver componentes celulares es el fijador más
• Buen poder de penetración y difusión empleado en la técnica
• Producir cierta dureza en los tejidos histológica ordinaria
• Fácil de conseguir y barato (fijador universal).
• Fácil manejo

Pasos para una buena fijación:

✓ Mientras más pronto, mejor Fijador para MET:

✓ Tamaño de las muestras (0.5 - 1cm³) Glutaraldehído al2.5%
✓ Relación de volumen 1:20
✓ Fijador correcto Fijador para lípidos:
✓ Fijar a 4°C Tetróxido de osmio
Se hace con el fin de eliminar el exceso de formol.

Proceso en el que los tejidos adquieren dureza y consistencia

para facilitar su corte sin que se distorsione la imagen del tejido
y permita el paso de la luz para ser observado en el microscopio
óptico, mediante sustancias llamadas “de inclusión”.

La más común es la parafina, una sustancia oleosa (no miscible

en agua).

DESHIDRATACIÓN
Se realiza con soluciones de
etanol en concentraciones
crecientes hasta llegar al 100%.
INFILTRACIÓN
La parafina penetra la muestra y
se solidifica sin afectar las
características del tejido,
formandoel bloque.
¡También nos permitirá
preservar la muestra durante
largos periodos de tiempo!
Solventes como el xilol
degradan lasgrasas
1
DIAFANIZACIÓN/
2 ACLARAMIENTO
Se realiza con soluciones de xileno
o tolueno (líquidos miscibles en
etanol y parafina)en
3 concentraciones crecientes hasta
llegar al 100% y decrecientes de
alcohol hasta llegar al 0%.
¡Otorga transparencia a los tejidos
y nos permite formar un puente
entre la parafina y el alcohol!
Inclusión en parafina:
https://www.youtube.com/
watch?v=irlymU-anio&t=9s
 Por lo general se hacen de 3 a 5 micras, con
micrótomos ya sean de rotación o de deslizamiento.

Hay que llevar a cabo una serie de procesos sobre el

bloque de parafina antes de hacer el primer corte
útil a nuestra muestra:

Los dos aparatos más

usados para realizar cortes
por congelación son el
microtomo de
congelación y elcriostato.

Retallado del bloque: https://www.youtube.com/watch?v=cecEVc2ZRVs&t=1s

Obtención de cortes:
https://www.youtube.com/w
atch?v=nLZyTwOZZTk&t=2s
Montaje desecciones:
https://www.youtube.com/watch?v=psBVVnn54Tw&t=5s
✓ Una vez comenzado el corte de
nuestra muestra se obtienen tiras
de secciones unidas por las caras
paralelasa la cuchilla.
✓ Estas tiras han de estirarse para
que nuestro tejido quede
perfectamente extendido.
✓ Aprovechando la hidrofobicidad de
la parafina, las secciones se
colocan sobre agua calentada a
unos 35 °C a 40 °C y el calor las
hace extenderse sin llegar a su
punto de fusión.
✓ El estiramiento se puede realizar
en baños de agua con regulación
térmica o sobre los propios
portaobjetos cubiertos de agua y
colocados sobre una plancha
térmica regulable.
 Corte
transversal

Corte
longitudinal
 La mayoría de los tejidos, sobre
todo los de los animales, son
incoloros y porello necesitamos
teñirlos para observar sus
DESPARAFINADO características morfológicas con el
Se realiza con soluciones de 1 microscopio óptico.
xileno o tolueno.
REHIDRATACIÓN
2
Con soluciones de etanol en
concentraciones decrecientes
TINCIÓN hasta llegar al 0% antes de realizar
Se consigue con el uso de los 3 la tinción, puesto que estos
colorantes, sustancias colorantes son hidrosolubles.
coloreadas que son capaces
de unirse de manera más o
menos específica a
estructuras del tejido
aportándoles color.
 DESHIDRATACIÓN
Se realiza con soluciones de etanol 3
en concentracionescrecientes
hasta llegar al 100% para extraer el
agua propia de los colorantes.
ACLARAMIENTO
4
Se realiza con soluciones de xileno
o tolueno en concentraciones
Tinción con H&E: crecientes hasta llegar al 100% para
https://www.youtube.com/w aumentar la transparencia de la
atch?v=NPOqiPyaxo0&t=2s muestra.

Se adhieren con gotas de

manera permanente, y en esta etapa se cubre medio de montaje
el corte del tejido ya procesado, y adherido a transparente, como el bálsamo
un portaobjetos, con un cubreobjetos. de Canadá (resina sintética).
✓ Para la observación con detalle de la ultraestructura celular es necesario
realizar secciones muy delgadas, del orden de nanómetros, denominadas ultrafinas,
y observarlas con el microscopio electrónico de transmisión (MET).
✓ Para ello se incluye la muestra en resina, generalmente de tipo epoxy, que una vez
polimerizada resulta en un bloque de gran dureza.
✓ La obtención de secciones ultrafinas se lleva a cabo con un aparato
denominado ultramicrotomo, que emplea cuchillas con filo de diamante, que son
mucho más caras.
✓ Las secciones ultrafinas recién obtenidas
quedan flotando sobre una balsa de agua
que posee la propia cuchilla y no se
recogen sobre portaobjetos sino
directamente sobre soportes de níquel o
cobre denominados rejillas.
 ✓ La molécula de un colorante tiene normalmente dos componentes importantes:
uno que aporta el color, denominado cromógeno, y otro que posibilita la unión a
elementos del tejido denominado auxocromo, generalmente un grupo ionizable.
✓ Los colorantes son normalmente hidrosolubles, aunque hay colorantes que
carecen de grupos ionizables y sirven para teñir sustancias grasas, como gotas de
lípidos.

Según la naturaleza química del radical auxocromo los colorantes se clasifican en:

Básicos Ácidos Neutros Mordien Indiferentes o

(catiónicos) (aniónicos) tes hidrofóbicos
Eosinato de
Tionina, safranina, Fucsina ácida, azul de Hematoxilina Sudán
azul de toluidina, verde rápido, metileno. férrica de
el azul de naranja G o la Heidenhain.
metileno o la eosina.
hematoxilina.
Metacromasia

Ciertos colorantes reaccionan con diferentes componentes del tejido, tiñéndolos en

diferente color al del colorante que originalmente había sido utilizado.

Colorantes metacromáticos: • Azul de metileno • Café de Bismarck

• Azul detoluidina • Safranina
• Azure A, B,C • Cristal violeta
• Azul de tionina • Violeta de metilo

Ortocromasia Se respeta el color del colorante.

Pancromasia Mezcla de varios colorantes neutros, da

como resultado varios colores y tonalidades.

Ejemplo: tinción de Wright

 Hematoxilina
✓ Colorante natural más utilizado
✓ Se extrae del palo de Campeche
✓ Solución hidrofílica
✓ Catión
✓ Base
Tiñe estructuras ácidas de color
azul o morado:
• Cromatina (material
genético) dentro del núcleo
• Nucleolo
• Ribosomas
• Glicosaminoglucanos
• RER
Eosina
✓ Colorante más usado en
soluciones alcohólicas
✓ Anión
✓ Ácido
Tiñe estructuras básicas
(proteínas) en tonos de rosa:
• Citoplasma en rosa
• Músculo en tonos rojizos a
rosados fucsia
• Glóbulos rojos en naranja o
rojo
• Fibrina en rosa intenso
• Colágeno
BASOFILIA: propiedad de las
estructuras ácidas para teñirse
con un colorante básico.

ACIDOFILIA: propiedad de las estructuras

básicas para teñirse con un colorante ácido.
 MÉTODOS TRICRÓMICOS
Se emplean tres colorantes para teñir distintos
componentes en diversos colores.

Tricrómico de
Masson
Tricrómico
de Masson
Permite ver:

✓ Núcleos en negro
✓ Músculo, citoplasma y
queratina en rojo
✓ Colágena en azul o
verde dependiendo del
contraste que se use
 Tricrómico de
Gallego

Permite ver:

✓ Núcleos en rojo
✓ Músculo, citoplasma y eritrocitos en verde
✓ Colágena en azul
✓ Queratina en amarillo
 Tricrómico de
Gomori

Permite ver:

✓ Núcleos en azul a negro

✓ Músculo y citoplasma en rojo
✓ Colágena en azul
✓ Fibras elásticas, células β de los islotes
pancreáticos y los gránulos de la
hipófisis en tonos que van desde el
violeta hasta el morado
 Tricrómico de
Mallory

Permite ver:

✓ Núcleos, mielina y músculo en rojo

brillante
✓ Citoplasma en rojo pálido
✓ Queratina y eritrocitos en naranja
✓ Colágena, astrocitos, moco, amiloide,
matriz ósea, cartílago y otras sustancias
hialinas en diferentes tonos de azul
 En algunas ocasiones necesitamos resaltar elementos
tisulares de manera específica y para ello usamos
colorantes que tienen apetencia por dichas estructuras.

SANGRE PERIFÉRICA Tinción de Wright

MÉDULA ÓSEA Tinción de Giemsa

Ambas con resultados similares, se observan:

✓ Núcleos en azul
✓ Eritrocitos en rosa o naranja
✓ Cromatina y glóbulos blancos en morado
✓ Gránulos de eosinófilos en rosa
✓ Gránulos de neutrófilos en morado
✓ Citoplasma basófilo en linfocitos y monocitos
CARBOHIDRATOS

Ácido peryódico
de Schiff (PAS)

• Mucina/moco (glucoproteínas)
• Glucocálix

Carmín de Best

• Glucógeno
LÍPIDOS
Si se desea evidenciarlos se
recomienda hacer cortes por
congelación y teñircon:

• Sudán negro
• Sudán III
• Sudán IV
• Rojo oleoso
• Tetróxido de osmio
(empleado en microscopía
electrónica)
 TEJIDO NERVIOSO

Luxol Fast Blue Nissl

✓ Mielina en azul ✓ Células nerviosas en azul brillante

✓ Membranas basales, hongos y ✓ Fondo menos azul
cuerpos neuronales en rosa
 Klüver Barrera ÁCIDOS NUCLEICOS

✓ Mielina y fosfolípidos en azul Técnica de Feulgen

✓ Células en tonos que van del
rosa al violeta
Cuando el tejido se trata con ácido clorhídrico, el
RNA se degrada, pero el DNA mantiene mejor su
estructura, lo que hace evidente la posición de los
cromosomas en el citoplasma durante la mitosis.

✓ Cromosomas de color magenta

 PIGMENTOS

Fontana-Masson PAS

✓ Melanina en negro ✓ Lipofuscina se

✓ Núcleos ycitoplasma aprecia rojo-magenta
de rosa a rojo
 Se observan de un rosa muy pálido
FIBRAS ELÁSTICAS en cortes teñidos con H-E, por lo que
se requieren tinciones especiales:

Reyes Mota Reyes Gallego

Verhoeff

Orceína
 No se observan con la tinción
FIBRAS RETICULARES H-E y se hacen evidentes con
impregnaciones argénticas:

Wilder
Pío del Río
Hortega
 ORGANITOS

Da Fano Bensley o Cains

✓ Aparato de Golgi se ✓ Mitocondrias se aprecian

observa en imagen positiva de color magenta
✓ Núcleo en imagen negativa
 Técnica en la que se aprovecha la especificidad antígeno-anticuerpo.

Se identifica un antígeno específico por medio de un anticuerpo asociado con

una enzima (inmunohistoquímica) o con un fluorocromo
(inmunofluorescencia) de interés a detectar.

Método más utilizado

en nefropatías y
dermopatías.

La prueba no sólo
revela si está presente
la proteína sino
una cantidadrelativa
de esta.
Inmunohistoquímica
enzimática con anticuerpos
anti proteína S-100
Inmunofluorescencia
 ✓ Se utilizan para identificar y localizar enzimas en células y tejidos.
✓ Se debe tener un cuidado especial en la fijación con el fin de preservar la
actividad enzimática.
✓ Se detecta el producto de reacción de la actividad enzimática y no la enzima
propiamente dicha.
✓ Se utiliza un reactivo de captura, ya sea un colorante o un metal pesado, para
atrapar o fijar el producto.

Localización de
la ATPasa de Localización de
membrana en la peroxidasa
células en macrófagos.
epiteliales.
Las impregnaciones metálicas emplean sales de plata (tonos de café a negro) que
se adhieren a la superficie de las células, en especial a las del tejido nervioso.
 Metenamina
de plata

✓ Específica para
membranas basales
 Actividad
https://view.genial.ly/630449b7a034320017a
2c28e/interactive-content-quiz-pizarra-
animada