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Introducción al tema

Clonación recombinacional por puerta

John S. Reece-Hoyes y Albertha J.M. Walhout

El sistema de clonación recombinatoria Gateway se desarrolló para clonar múltiples fragmentos de

ADN en paralelo (por ejemplo, en formatos de 96 pocillos) de forma estandarizada utilizando las
mismas enzimas. La clonación Gateway se basa en las reacciones de integración y escisión
altamente específicas del bacteriófago λ dentro y fuera del genoma de Escherichia coli. Dado que
los sitios de recombinación (sitios "att") son mucho más largos (25-242 pb) que los sitios de
restricción, es muy poco probable que se produzcan por casualidad en los fragmentos de ADN. Por
lo tanto, la misma enzima de recombinación puede utilizarse para clonar de forma robusta muchos
fragmentos diferentes de tamaño variable en reacciones paralelas.

PRINCIPIOS GENERALES DE CLONACIÓN

Muchos enfoques experimentales utilizan construcciones informadoras para ayudar a comprender

la expresión y la función de las proteínas. Normalmente, estos constructos son vectores plasmídicos
diseñados para expresar una proteína informadora que indica la expresión espacio-temporal y/o la
función de una proteína de interés. Una proteína informadora puede expresarse sola bajo el control
exclusivo de una secuencia de ADN reguladora de interés, o puede unirse en una fusión traslacional
a una proteína de interés. Una proteína informadora puede ser una proteína fluorescente que pueda
visualizarse (por ejemplo, la proteína fluorescente verde, GFP), una enzima cuya actividad pueda
determinarse (por ejemplo, la luciferasa), o una etiqueta que aporte una propiedad bioquímica
específica a la fusión (por ejemplo, la glutatión-S-transferasa, GST). Por ejemplo, una construcción
en la que la GFP se fusiona con una proteína de interés, teniendo su expresión controlada por el
promotor del gen correspondiente, puede mostrar dónde y cuándo se expresa la proteína endógena
observando el patrón de expresión de la GFP.
Las construcciones reporteras se hacen normalmente transfiriendo la secuencia insertada -un
marco de lectura abierto (ORF) y/o un fragmento de ADN regulador (por ejemplo, un promotor)- a
un plásmido que codifica la proteína reportera, de manera que el ORF comparte el marco de lectura
del reportero. Los métodos de clonación convencionales utilizan endonucleasas de restricción para
generar tanto la columna vertebral del vector como la(s) inserción(es) con extremos compatibles, de
modo que puedan unirse para formar un plásmido circular, utilizando ADN ligasa. De este modo, la
creación de construcciones está limitada por la presencia o ausencia de sitios de digestión
apropiados tanto en el fragmento de ADN como en el vector, y es muy poco probable que dos
construcciones reporteras utilicen la misma combinación de enzimas de restricción. Estos factores
hacen que la generación de más de unas pocas construcciones informadoras diferentes utilizando la
clonación convencional sea un reto y que la generación de colecciones de todo el genoma para la
investigación de alto rendimiento sea imposible.

PRINCIPIOS BÁSICOS Y APLICACIONES DE LA CLONACIÓN DE PUERTAS

El sistema de clonación recombinatoria Gateway se desarrolló para clonar múltiples fragmentos de

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ADN en paralelo (por ejemplo, en formatos de 96 pocillos) de forma estandarizada utilizando las
mismas enzimas (Hartley et al.

De la colección Molecular Cloning, editada por Michael R. Green y Joseph Sambrook.

2018 Cold Spring Harbor Laboratory Press
Cite esta introducción como Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.top094912

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J.S. Reece-Hoyes y A.J.M. Walhout

2000; Walhout et al. 2000; Reboul et al. 2001). La clonación Gateway se basa en las reacciones de
integración y escisión altamente específicas del bacteriófago λ dentro y fuera del genoma de
Escherichia coli (Hartley et al. 2000). El sistema de clonación Gateway utiliza dos mezclas de
enzimas diferentes, cada una de las cuales realiza un tipo distinto de reacción de recombinación. La
mezcla de enzimas clonasa BP recombina sitios attB con sitios attP, generando sitios attL y attR;
mientras que la mezcla de enzimas clonasa LR cataliza la reacción inversa (Fig. 1A). Cada evento
de recombinación es preciso, sin ganar ni perder nucleótidos. El reconocimiento de los sitios att es
extremadamente específico (es decir, las enzimas clonasa BP nunca utilizan sitios attL o attR), por
lo que cada reacción de recombinación genera sólo un conjunto de derivados. Los cuatro tipos de
sitios att se diferencian por la presencia/ausencia de "brazos" (Fig. 1B) a ambos lados de una
"región de reconocimiento" central de 25 pb. "Los brazos contienen sitios de interacción para las
enzimas de recombinación. Dentro de la región de reconocimiento hay un "solapamiento
asimétrico" de 7 pb que es el lugar en el que el ADN se corta y se vuelve a unir (Fig. 1C). La
introducción de cambios de nucleótidos dentro de la región de reconocimiento de 25 pb (Fig. 1C)
se ha utilizado para diseñar diferentes subtipos de sitios att que se recombinan sólo entre sí (es
decir, sitios attB1 con sitios attP1, pero no con sitios attP2 o attP3). Estos diferentes conjuntos de
sitios att facilitan la clonación de cada fragmento de ADN en una sola orientación (Fig. 2) en cada
vector (por ejemplo, colocando un sitio attB diferente en cada extremo).
Para cada fragmento de ADN de interés (por ejemplo, promotor, ORF, 3′ UTR), se genera
p r i m e r o un "clon de entrada" mediante una reacción de clonación BP Gateway en un "vector
donante" (Fig. 2). Normalmente, el fragmento de ADN que contiene el ORF o la secuencia
reguladora se amplía inicialmente mediante PCR utilizando cebadores de cola larga (~50 pb) con la
parte 3′ de los cebadores especific para el ADN de interés y la cola 5′ de los cebadores que
contienen sitios attB adecuados. Este producto de PCR se transfiere entonces a un vector donante
con sitios attP compatibles. El fragmento de ADN de un clon de entrada está ahora disponible para
su transferencia a muchos tipos de "vectores de destino" mediante una reacción de clonación
Gateway LR (Fig. 3). Es importante destacar que los cebadores utilizados inicialmente para clonar
cada ORF pueden diseñarse para eliminar los codones endógenos de inicio/parada y para que
coincidan con el marco de lectura utilizado por todos los vectores de destino que expresan
proteínas de fusión aminoterminal o carboxi-terminal. Este marco de lectura no se modifica en las
transferencias entre vectores porque las recombinaciones de Gateway son precisas. Pueden
utilizarse reacciones Gateway LR más avanzadas para incorporar los fragmentos de ADN de más
de un clon Entry (por ejemplo, promotor y ORF) en una única construcción Destination (Fig. 4).
Este enfoque es extremadamente útil para generar construcciones complejas, en las que, por
ejemplo, un promotor y un ORF se fusionan con un ORF que codifica GFP. Para seleccionar el
producto de recombinación deseado, todos los vectores de entrada y de destino contienen un
"casete Gateway", así como diferentes genes de resistencia a los antibióticos. El casete Gateway
contiene un gen de resistencia al cloram-fenicol y el gen tóxico ccdB (Bernard y Couturier 1992;
Miki et al. 1992) que confiere letalidad a las cepas estándar de E. coli (por ejemplo, DH5α). El
evento de recombinación intercambia el fragmento de ADN de interés con el casete Gateway, lo
que permite el crecimiento de las bacterias DH5α en medios que contienen el antibiótico requerido
(por ejemplo, kanamicina para los clones Entry, ampicilina para los clones Dest

A BP reacción:attB × attP → attL + attR LR C attB0 TCAAGTTAGTAAAAAAGCAGGCT attB1

reacción:attL × attR → attB + attP ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT attB2
ACAAGTTTGTAACAAAGCTGGGT attB4
CAACTTTGTAGAAGTTG
B attP
attB
attL
attR

FIGURA 1. Generación de un clon de entrada mediante una reacción Gateway BP. (A) Una reacción Gateway
BP utiliza las enzimas clonasa BP para recombinar un sitio attP con un sitio attB para generar un sitio attL y
un sitio attR, mientras que la clonasa LR realiza la recombinación inversa. (B) Los sitios attP, attL y attR
tienen "brazos" de reconocimiento a ambos lados de la "región de reconocimiento" (recuadro con punta de
flecha), mientras que los sitios attB no tienen brazos. Estos brazos contienen sitios de unión para las enzimas
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de recombinación y se denominan "izquierda" y "derecha" con respecto al solapamiento asimétrico: los sitios
attL tienen un brazo a 5′ (o izquierda) del solapamiento (recuadro blanco), los sitios attR tienen un brazo a 3′
(o derecha, recuadro azul), y los sitios attP tienen ambos brazos. (C ) Los sitios attB son de ~25 pb y
presentan un "solapamiento asimétrico" central de 7 pb (recuadro) que determina dónde se corta y se vuelve a
unir el ADN. attB0 es el sitio que se encuentra de forma natural en el genoma de E. coli y que es utilizado por
el bacteriófago λ(Hartley et al. 2000). Se ha utilizado la mutagénesis para generar las otras variedades de sitios
attB.

2Cite esta introducción como Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.top094912

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Clonación recombinacional por puerta

Producto PCR B1-ORF-B2

del promotor B4- Producto de la PCR
B1R B1B2
B4B1R
Promotor ORF

X X
Casete de Casete de
entrada entrada
P4 P1R P1 P2
pDONR P4-P1R Propagar en la pDONR 221
bacteria
Kanr ori DB3.1.
Kanr ori

Pasarela BP reaction Pasarela BP reacción

L4 R1R L1 L2
Promotor ORF

Clon de Seleccione en ORF

entrada del la bacteria Clon de
promotor DH5α. Kanrentrada ori
Kanr ori

FIGURA 2. Generación de un clon de entrada mediante una reacción de PA de puerta de enlace. La creación
de clones de entrada, que se muestra aquí, implica la propagación de un vector donante en la bacteria DB3.1,
la amplificación de un producto de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con sitios attB compatibles
y, a continuación, la preparación de una reacción Gateway BP. Las enzimas clonasa BP recombinan los sitios
attB y attP, sustituyendo el casete Gateway por el inserto amplificado, que ahora está flanqueado por sitios
attL o attR, dependiendo de la configuración de los fragmentos de ADN y los vectores. La reacción mostrada
a la izquierda genera un clon de entrada del promotor, mientras que la mostrada a la derecha genera un clon
de entrada del ORF. Nótese que la clonación unidireccional está garantizada porque los sitios attB1 sólo se
recombinan con los sitios attP1, los sitios attB2 con los sitios attP2, y así sucesivamente. Después de que la
mezcla de reacción de BP se transforme en una cepa de clonación bacteriana estándar (como DH5α), sólo el
clon de entrada conferirá crecimiento. Obsérvese que, normalmente, el solapamiento asimétrico está orientado
5′-3′ hacia el inserto, pero los sitios att también pueden funcionar en la orientación inversa y entonces reciben
la designación "R" (por ejemplo, attB1R y attP1R). Estos sitios att inversos son importantes para generar
clones de entrada que puedan utilizarse en reacciones LR multisitio (Fig. 4).

clones). La cepa E. coli DB3.1 es resistente a los efectos del gen ccdB y se utiliza para propagar los
vectores Gateway en presencia de cloranfenicol.
Mediante la técnica Gateway, se han generado bibliotecas de clones de entrada y se han
derivado a clones de destino para su uso en estudios de alto rendimiento. Por ejemplo, los
aproximadamente 12.000 ORF de longitud completa disponibles en el ORFeome de
Caenorhabditis elegans (Reboul et al. 2003) se han transferido a vectores de hibridación doble de
levadura para determinar una red de interacciones proteína-proteína (Li et al. 2004). Del mismo
modo, muchos de los 6000 promotores del Promoterome de C. elegans se clonaron antes de la GFP
para el análisis de la expresión génica y para el mapeo de la red de regulación de la transcripción
mediante ensayos de hibridación en levadura de alto nivel (Dupuy et al. 2004; Deplancke et al.
2006; Vermeirssen et al. 2007). Cualquier construcción reportera puede adaptarse para aprovechar
las colecciones de clones de entrada de Gateway (véase el Recuadro 1). Las técnicas
experimentales recientes que se han hecho compatibles con Gateway incluyen la interferencia de
ARN (ARNi) (Rual et al. 2004) y los microarrays de unión a proteínas (Grove et al. 2009).

DESVENTAJAS DE LA CLONACIÓN DE PUERTA DE ENLACE Y DE LOS SISTEMAS DE CLONACIÓN

ALTERNATIVOS

La clonación Gateway funciona de forma extremadamente eficiente y robusta, y un investigador

puede generar cientos de construcciones en cuestión de días. La principal desventaja del sistema es
que, una vez que se ha hecho la conversión a la clonación Gateway, es bastante difícil cambiar a
otro sistema de recombinación o volver a los métodos de clonación tradicionales (por ejemplo,
porque a menudo se han eliminado los codones de inicio/parada y los vectores Gateway carecen de
sitios de endonucleasas de restricción convenientes). Otra limitación es que los vectores Gateway y
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las enzimas de recombinación son bastante caros. Sin embargo, según nuestra experiencia, la
relación coste-beneficio se vuelve favorable una vez que el número de construcciones reporteras
necesarias alcanza varias docenas. Las cuestiones restantes son técnicas, diferirán entre las
construcciones deseadas y se refieren en gran medida a la introducción de los sitios att (los sitios
att podrían, por ejemplo, cambiar potencialmente la funcionalidad de la fusión de proteínas
resultante o añadir sitios cis-reguladores a un fragmento promotor). Sin embargo, hemos

Cite esta introducción como Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.top0949123

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J.S. Reece-Hoyes y A.J.M. Walhout

Amp ori Amp ori

r r

Vector de destino Vector de destino

R4 L1R R1 R2
Casete de entrada Reportero Fusión Casete de entrada

X X X X
Promotor ORF
L4 R1R L1 L2
Clon de ORF
entrada del Clon de
promotor entrada
Kanr ori Kanr ori

Reacción LR reaction Gateway LR Gateway

B4 B1R B1 B2
Promotor Reportero Fusión ORF

Promotor Clon de ORF

destino Clon de destino

Ampr ori Ampr ori

FIGURA 3. Generación de un clon de destino mediante una reacción Gateway LR. En una reacción Gateway
LR, un clon de entrada se mezcla con un vector de destino y las enzimas de clonación LR recombinan los
sitios attL y attR del subtipo correspondiente (es decir, attR4 con attL4, attR1 con attL1), intercambiando el
casete Gateway con el inserto clonado. La reacción de la izquierda genera una construcción reportera con un
promotor clonado aguas arriba de un reportero como GFP o luciferasa. La reacción de la derecha genera una
construcción reportera con un ORF clonado dentro del marco con un reportero amino-terminal como GST o los
elementos de levadura de dos híbridos (AD o DB).

En el pasado, se ha demostrado que es poco probable que los sitios att interfieran con las lecturas
de los ensayos de hibridación en levadura (Walhout et al. 2000; Deplancke et al. 2004). Para cada
ensayo posterior, deben utilizarse los controles adecuados para determinar si los sitios att afectan a
los resultados. Por último, los vectores Gateway Destination pueden reconfigurarse si es necesario,
por ejemplo, para generar extremos de proteína libres desplazando la fusión del extremo amino-
terminal al carboxi-terminal o introduciendo un nuevo codón de inicio/parada de forma que los
sitios att no se traduzcan.
El sistema de clonación Gateway no es la única opción basada en la recombinación para
generar construcciones reporteras. Los sistemas Univector (Liu et al. 1998) y Creator (Siegel et al.
2004) utilizan la recombinasa Cre del bacteriófago P1 (Abremski y Hoess 1984) que cataliza la
recombinación en loxP

Ampr ori

Vector de destino
R4R2
Gateway cassetteFusion Reacción de la puerta de enlace multisitio LR
Ampr ori

Promotor::ORF
Clon de destino
Promotor ORF Fusión
B4 B1B2

FIGURA 4. Reacciones Gateway LR multisitio. En una reacción Gateway LR multisitio, se mezclan dos clones
de entrada con un único vector de destino y, al igual que en la reacción LR mostrada en la figura 3, las
enzimas clonasa LR recombinan los subtipos correspondientes de sitios attL y attR. Sin embargo, el resultado
de este tipo de recombinación es que los insertos de los dos clones de entrada (por ejemplo, un promotor y un
ORF) se fusionan al sustituir el casete Gateway.
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4Cite esta introducción como Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.top094912

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Clonación recombinacional por puerta

CUADRO 1. GENERACIÓN DE VECTORES COMPATIBLES CON LA PASARELA

Hacer que el vector informador deseado sea compatible con Gateway implica utilizar endonucleasas
de restricción convencionales y ligar para clonar un casete Gateway flanqueado por sitios att en la
posición adecuada dentro de la columna vertebral del vector y luego transformar y propagar el
producto circular en la cepa DB3.1 de E. coli. Dado que este nuevo plásmido funcionará como un
vector de destino que recibe un inserto de un clon de entrada, es importante utilizar sitios att que
sean compatibles (por ejemplo, si su vector necesita aceptar ORF de clones pDONR 221, entonces
debe tener sitios attR1-attR2). Dependiendo del vector, también puede ser importante clonar los
sitios att en un marco determinado (es decir, para que cada ORF recombinado se exprese dentro del
marco con una fusión amino o carboxi-terminal). Los fragmentos de ADN con extremos romos que
contienen el casete Gateway flanqueado por los sitios attR1 y attR2 están disponibles en el mercado en
los tres marcos para su ligación en el vector de interés. Si se necesitan sitios att diferentes, se
pueden amplificar fragmentos similares a partir de vectores existentes mediante PCR. Si no se
dispone de vectores con los sitios att necesarios, los sitios att existentes pueden modificarse
mediante mutagénesis mediada por PCR.
mientras que los sistemas In-Fusion (Berrow et al. 2007), MAGIC (Li y Elledge 2005) y SEFC
(Zhu et al. 2009) utilizan la recombinación homóloga in vitro o dentro de cepas de E. coli. Todos
estos sistemas de clonación alternativos se han utilizado para generar grandes bibliotecas de
construcciones reporteras. Los sistemas basados en Cre son superficialmente similares a Gateway,
pero la falta de variedad de sitios de recombinación y vectores de destino limita las opciones
experimentales. Las principales ventajas de la recombinación homóloga son (i) que no requiere la
compra de enzimas recombinasas y (ii) que no se utilizan sitios de recombinación que puedan
interferir con el experimento. Sin embargo, una desventaja significativa de este enfoque es que las
reacciones de transferencia no siempre son precisas y, por tanto, se requiere la confirmación de la
secuencia de las construcciones finales. En la Tabla 1 se enumeran otras ventajas y desventajas de
cada sistema de clonación.
El sitio web de Life Technologies (Invitrogen, http://www.invitrogen.com), la fuente comercial
de todos los reactivos de clonación Gateway, presenta protocolos completos (y más información de
fondo) para el sistema Gateway. Los siguientes protocolos asociados son los más comunes
utilizados en la clonación Gateway. El primer protocolo asociado describe cómo propagar

TABLA 1. Ventajas y desventajas de los diferentes métodos de clonación basados en la

recombinación Clonación
sistema(s)MétodoInventajasDesventajas

Recombinasas BP y LR basadas en Gatewayλ que No hay ganancia/pérdida de nucleótidos
utilizan sitios att durante la transferencia No se requiere
Completamente in vitro digestión
Recombinación-reversible
Usos Clones de entrada
Decenas de vectores de destino
disponibles Posibilidad de
transferencias multisitio
Gran variedad de sitios de
recombinación
Creador Recombinasa Cre basada en No hay ganancia/pérdida de nucleótidos
de P1 que utiliza sitios loxP durante la transferencia No se requiere
univect Completamente in vitro digestión
ores Usos Clones de entrada
In-Fusion, Recombinación homólogaaNo hay sitios de recombinación
MAGIC, No es necesaria la compra de enzimasa
SEFC Son posibles las transferencias
multisitio
Se puede utilizar cualquier vector sin
Necesidad de comprar enzimas Los
sitios de recombinación pueden
interferir con
experimento
Necesidad de hacer compatible el vector
deseado
Necesidad de comprar enzimas Los
sitios de recombinación pueden
interferir con
experimento
Recombinación irreversible
Pocos vectores de destino
disponibles No son posibles las
transferencias multisitio Variedad
limitada de sitios de recombinación
Necesidad de hacer compatible el vector
deseado
conversió
n
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Ganancia/pérdida nucleótidos durante la transferencia No utiliza clones de entradab

ocasional de Necesidad de generar el inserto mediante PCR o digestión antes de la
recombinación
aLa fusión es un sistema in vitro que requiere la compra de enzimas, mientras que para MAGIC y SEFC la recombinación se produce dentro de las cepas de E. coli.
bEs posible tener una configuración de tipo clon de entrada en el sistema MAGIC.

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J.S. Reece-Hoyes y A.J.M. Walhout

Vectores Gateway que contienen casetes Gateway funcionales (véase el Protocolo: Propagación
de vectores Gateway [Reece-Hoyes y Walhout 2018a]); dos protocolos adicionales implican la
manipulación de estos vectores con enzimas de recombinación Gateway para generar clones de
entrada y de destino. De estos, un protocolo describe cómo generar un clon de entrada ORF
utilizando la clonación BP, seguido de la transferencia LR del ORF a un vector de destino (ver
Protocolo: Generación de un clon de entrada de marco de lectura abierto (ORF) y clon de
destino [Reece-Hoyes y Walhout 2018b]). El protocolo final describe una reacción Gateway
multisitio durante la cual un promotor y un ORF se transfieren simultáneamente desde dos clones
de entrada diferentes al mismo vector de destino utilizando enzimas LR (véase el Protocolo: Uso
de la clonación LR multisitio para generar un clon de destino [Reece-Hoyes y Walhout
2018c]). Los tres protocolos hacen uso de vectores y reacciones de transferencia específicos; sin
embargo, estos pasos pueden aplicarse a cualquier vector Gateway y reacción de transferencia
simplemente sustituyendo los detalles específicos del vector requerido, como los sitios att, el
antibiótico de selección y la mezcla de enzimas recombinasas.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) con las becas DK068429 y
GM082971 A.J.M.W.

REFERENCIAS

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6Cite esta introducción como Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.top094912

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Clonación recombinacional por puerta

John S. Reece-Hoyes y Albertha J.M. Walhout
Cold Spring Harb Protoc; doi: 10.1101/pdb.top094912

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