Clase nº6:

Cosmidios y fagos: Aplicaciones de DNA recombinante

Si se quiere clonar por ejemplo un

DNA cromosomal (DNAcro) se puede
hacer en un vector plasmidial, pero se
verá mas adelante que esto no es lo más
adecuado cuando se quiera clonar
segmentos grandes de DNA.
En la imagen lo que se ve es que
por un lado se linerializa el vector, por otro
se digiere DNAcro, se hace un ligamiento
y se tendrá como resultado clones con
vectores con segmentos de DNA de
distintos tamaños, pero también se
obtendrá solo vector. Aquí es donde se
debe optimizar para tener resultados
aceptables para realizar una librería
genómica.

Cosas que deben estar dentro de un

vector:
-Origen de replicación (visto en
clases anteriores) donde se tiene que
tomar en cuenta, por ejemplo, si se quiere
tener un gran nº de vectores que tienen
que ser compatibles estos orígenes. O si
se quiere tener un plasmidio de expresión, tener un origen de replicación con nº alto de copia.
-Marcador selectivo como resistencia a antibióticos.
-Sitios de corte único con enzimas de restricción para realizar clonamiento.

Se explicará un concepto que se usará mucho en esta clase y deberiamos estar

familiarizados y es el de la PAFFFFF!!!!....genética, que es un concepto muy utilizado, que
clonar usando una fusion genetica de muchas parte no puede ser tan tribial, acá se presenta un
vector de fusión que tiene fusionada una proteína, una proteína del operon de la maltosa que
además puede ser exportada, pero en este caso es un TAG que tiene la proteína, ya que, al
pasar la proteína por una columna de afinidad uniendo la maltosa a la columna y luego
cortando con una proteasa especifica que corta específicamente en un sitio especifico jejeje.
También existen TAGs de histidina, que se relaciona con una columna de níquel.
También existen “trucos” visuales para distinguir recombinantes exitosos que es el caso
de cepas lacZ+, que se tornan color azul con un sistema ya conocido y las no recombinantes
con color blanco.
Se tiene que tener en cuenta en los vectores de expresión, tener un promotor, ejemplo
“Ptac” que un promotor artificial, una fusión entre promotor de lactosa y triptofano con la -35 de
una y -10 de otra se ha generado un promotor casi consenso y es excelente y este puede ser
susceptible a la regulación por el operon lac. Habitualmente estos sistemas de expresión, casi
todos tienden a ser regulables, de modo que expresen en el momento que uno lo desea. Se
usa mucho el sistema de operón lac, porque
tiene un operador que se puede poner delante y
produce que la proteína de represión lac se una
y no se exprese. Pero, cómo se regula
positivamente esto? Se agrega inductor y este
se une al represor y hay transcripción, como por
ejemplo el IPTG (algo no hidrolizable de la
lactosa).

Pregunta cote: No entendí que era el malE.

(Nótese que la weá no es pregunta)
Respuesta: es una proteína que se usa como tag (de fusión). Que sirve para poder aislar la
proteína más fácilmente, ya que, con una columna de afinidad con maltosa esta quedará
retenida y será muy simple su purificación. Actualmente la más usada es la colita de histidina
(tag de his), ya que significa un menor cambio en la proteína (son unas 6 u 8 histidinas de
más), mientras que poner malE significa agregar un pedazo de 20 a 30kDa. Luego, hay que
diseñar este sitio para el corte con una proteasa y cuidar que no este dentro de la proteína que
se está clonando (duh). Después la profesora deja una idea muy inconclusa…

La siguiente diapositiva 4, se muestra esencialmente lo mismo, “trc” = “Ptac”, SD (Shine-

Dalgarno) y se muestran 2 terminadores de la transcripción (T1 y T2) que tienen que estar
presentes, ya que, como se mencionó este promotor es muy potente y se necesita tener
secuencias terminadoras porque la sobreexpresión de la transcripción puede ser perjudicial
para la célula. En este caso el gen represor del operador lac (lacI) está bajo el promotor y
estará siempre expresado; luego, esto estará siempre reprimido amenos que se agregue IPTG.

Espaciamiento óptimo entre codón de inicio AUG y secuencia SD, es 9-8 pb.

Quimeras entre proteínas con genes reporteros, GFP, etc etc etc. Para hacer proteínas de
fusión se puede hacer de 2 formas, con extremos romos o cohesivos, salvedad con cohesivos
es que hay que procurar que no se corra el marco de lectura.

Todo lo anterior fue un preámbulo para mostrar que cosas tiene un vector.

FAGO 

Nuestro amigo se usa como herramienta de DNA recombinante:

- Para clonar segmentos grandes de DNA: todavía se usa, la frecuencia de infección de

una partícula viral, se compara con los otros procesos de conjugación o transformación, para el
ingreso de DNA a una célula, es el más eficiente.

Recordando: fago lambda tiene alrededor de 50kb. En la representación

lineal de arriba, tiene los extremos cos cohesivos, y tiene una región central que no es tan
importante en la preparación viral que es regulatoria mas bien y los genes de la recombinación,
eventualmente se puede suprimir esta región y el fago se puede propagar como una partícula
viral. Se diseñaron vectores en que uno puede clonar. Modificando la secuencia y quitando
algunos sitios de restricción del fago. Y se podía clonar en el fago un segmento de DNA de
20kb y esto se usó mucho para librerías genómicas. También se puede diseñar el vector de tal
manera para tener marcadores como lacZ, entonces si se reemplaza en esta zona se tendrá
una cepa Lac-.

Totalmente divagando la profe…introduce el tema de cómo hacer una librería

genómica. Esta weá supongo que todos cachan, así que no la explicaré, en todo caso sale algo
en las diapos 7, 8. Es importante recalcar que hay que tener un número representativo de
clones recombinantes para el genoma completo, hay una fórmula que hemos visto y revisto.
Una de las gracias del Fago lambda es que se puede hacer empaquetamiento in Vitro,
diapositiva 9. La salvedad es que haya un tamaño especifico entre región cos y cos. Se vende
ahora el pack de fago como vector.
Diapo 11, muestra como una sonda radiactiva sirve para buscar en que cepa de la
librería genómica esta el gen de interés.
 Hay una alternativa a la partícula viral, tranquilos. Estos vectores se les llama de tipo
CHARON, los de serie CHARON son partículas virales del fago lambda. Yo puedo tener una
librería en puras placas de lisis, lindo cierto?

Ahora, se habla de un concepto nuevo, Cosmidio, que es un plasmidio pero que en

algún momento de la construcción tiene la capacidad de encapsularse en una partícula viral,
que va a ser infectiva, pero una vez inyectado en la célula en vez de propagarse como virus lo
va a hacer como plasmidio.
¿Cuál es la ventaja de esto? es que, cuando se hace el empaquetamiento uno tiene la
partícula viral que se usa para infectar y se usa para hacer la librería y después se trata como
plasmidio, pero con la salvedad de que uno puede meter le puede meter solo 50kb a la célula.

¿Que va a necesitar un cosmidio?

- Origen de replicación
- Gen de resistencia
- Extremos cohesivos
- Sitio de clonamiento o sitios de restricción
Todo el resto de DNA se puede usar para poner el DNA que uno quiera.
Diapo 13 se muestra un ejemplo de cómo lo hizo la profe en su laboratorio para la
librería genómica de Klepsidia sp. El empaquetamiento se hace in Vitro. Sau3A y BamHI
generan extremos cohesivos compatibles.

Se habla de la técnica del terciopelo, una técnica muy antigua pero usada para hacer
las replicas de placas. Imagínenselo, es como un timbre con una copia de una placa.
Para hacer la hibridación con sondas y reconocer una colonia de la librería con un DNA
de interés se copia primero la placa en un filtro de nitrocelulosa, luego se trata con álcali (creo
que dice eso) para romper células y proteínas, pero el DNA (de bacteria y fago) se pega en el
filtro. Luego, el resto del filtro que no ha sido transferido (entiéndase que no tiene nada pegado)
se “bloquea” con por ejemplo BSA (bovine serum albumine) o con leche. Luego se hace la
hibridación por sondas o por anticuerpos, etc.

Cambiando el tema, cDNA. Se hace a partir del mRNA con la transcriptasa reversa y se
crea el cDNA (proceso en diapo 15) y por ejemplo, si se quiere expresar proteína eucarionte en
bacteria hay que hacer esto porque no tiene la maquinaria de splicing, etc. Se usa
generalmente para hacer una librería de expresión eucarionte. Librería genómica es genoteca.
LAMBDA gt11 se usa mucho para clonar cDNA, insertos de no más de 7,2kb, clonados entre
lacZ y se reconocen placas incoloras.
Pero si yo quiero ver expresión de una proteína específica, solo me van a servir las
proteínas que se inserten EN el marco de lectura de lacZ, que serán las proteínas expresadas
funcionales. Y estas solo serán reconocidas por anticuerpos específicos para la proteína en
cuestión. Luego, a partir de eso por ejemplo si yo desconociese la secuencia de la proteína,
podría verla desde las colonias que reconocen al anticuerpo. Por otro lado, las colonias que
tengan el cDNA pero no este en el marco de lectura de lacZ no serán reconocidas por el
ensayo de anticuerpos.

Se pregunta si las librerias de expresión se explicita de donde (de que tejido) se sacó,
porque una genoteca se puede sacar de cualquier lado, mientras que la otra no.
Ahora secuenciar es muy barato en relación a años pasados, la profe dice textual: “un
genoma eucarionte es extremadamente caro, pero un genoma bacteriano, se juntan entre 5 y
demás que lo pagan”. Así que propongo que hagamos una vaca y secuenciemos alguna weá.

Se puede también tener ambas librerías y contrastar gen con secuencia de expresión
de un gen, ahí uno puede dar cuenta de los sitios de splicing y del splicing alternativo.

El plato principal:

Fago T7:
Promotor de T7 se usa muchísimo-muchísimo, como promotor controlable para la
expresión de genes de lo que sea.
 Se muestra el “sistema original” y después se verá el sistema comercial:

Se muestra el pT7-7; “p” por plasmidio, T7 por T7 y -7 porque es de la serie T7 y

variante 7. Tiene:
-Ori de ColE1
-bla (gen de la  lactamasa, resistencia a ampcilina)
-Y se muestra el amplificado de una zona que presenta el promotor de T7, el rbs
(ribosome binding site), y el sitio de multiple clonamiento donde se ve que se puede usar
cualquier enzima de las que se ve ahí para ligar la proteína y depende de lo que uno quiera va
a clonar en alguno de los sitios. Si uno buscase la mayor fidelidad a la wt (wild-tipe) se deberia
clonar en el sitio NdeI que parte con el codon de inicio ATG y habría que lograr que empalme
con el atg de la proteína de interés.

¿Cual es la gracia de esto?

Se va a tener un plasmidio que no va a transcribir a no ser que se le proporcione la
polimerasa del fago T7, que esta clonada en un plasmidio compatible (derecha). Pero este
plasmidio también tiene que estar controlado por algo, y en este caso puntual esta controlado
por “PL” (promotor left del fago lambda). Por lo tanto, si este esta controlado por el promotor P L,
para que no sea constitutiva la expresión tiene que estar el represor del fago lambda (cI), que
esta clonado en el mismo plasmidio en este caso. Y este represor, para el ejemplo, es una
variante termosensible, es decir, en una temperatura permisiva se estará expresando el
represor siempre por ende reprimiendo la expresión de la polimerasa de T7, pero si se eleva a
la termperatura restrictiva de 42ºC se inactiva el represor y existirá expresión del gen clonado
en pT7-7. Haga ud. el camino de vuelta desde pGP1-2 hasta la expresión de pT7-7 como
ejercicio y lo entenderá mucho mejor.

Luego, esto se mejoró, nadie es simpatizante de 2 plasmidios, muchos sitios de

restricción que tomar en cuenta para clonar, disminución de frecuencia de éxito por tener que
ingresar 2 plasmidios, etc. Siempre es mejor lo más shico (más facil de manejar, mas tierno,
mas empeñoso, etc). Lo que se hizo fue integrar el sistema del segundo plasmidio en el
cromosoma bacteriano. Y ¿cómo se hace esto? Se hace mediante un PAFFFFFFF
ontogénico????? Se pueden poner cosas en el cromosoma (una wea así).

Lo que pasó, fue que se creó la serie pET. Que se puso el gen de la polimerasa T7, con
el represor lambda (lacI) (es decir, inducible por IPTG) río arriba. A demás del promotor T7, al
pET, le pusieron el operador de lacZ para mejorarlo, por lo que está requerido esencial y
estrictamente el IPTG, ya que, induce en ambos lados.
 Existen otros “trucos” para el refinamiento de estos sistemas para que haya más
represión. Como es el caso de la polimerasa de T7 inactivada la adición de la proteína de la
lisis.

Diapo 20, ejemplo de laboratorio, lo que sucede es que: polimerasa de T7 es resistente

a rifampicina, mientras que la bacteriana no. La importancia de esto es que cuando se quiere
medir/detectar/ver la expresión de genes promovidos por T7 y no por promotores bacterianos.
Ejemplo: Cuando yo le agrego rifampicina al medio, lo que voy a ver, como la vida
media de los mensajeros es bastante corta, solo se expresarán las proteínas que tengan los
promotores de T7 si las induzco con IPTG. Además, si le agrego aminoácidos radioactivos, las
proteínas en cuestión se marcarán radiactivamente. Entonces, cuando corra un gel separando
fracción soluble de no soluble podré ver si hago una autoradiografía si la proteína expresada se
expresa en la fracción soluble o no y si está en la no soluble
también se puede ver si se expresa en la Mb interna o externa.

Fago Mu (la profe explicó realmente como el pico este fago y lo

que viene si no lo entienden nose que podemos hacer, es como
muy textual de lo que habló la profe)

Fago complicado, complejo y lisogénico. Tiene la

particularidad de ser un transposon, se puede ubicar en
cualquier punto del cromosoma y no tiene preferencia por
secuencia. En su ciclo de propagación incluye siempre
integración del genemoa de la bacteria para luego salir
encapsidado. A diferencia de los otros fagos tiene attL y attR
(pedacitos de cromosoma bacteriano), más pequeño el del lado
izquierdo.
Al ser transposón, se puede usar para mutar, pero tiene
el problema que al ser tan “saltarín” uno puede tener un mutante
no muy estable. Es promiscuo, sirve para infectar coli,
salmonella, vibrio, etc.
Tiene transposasa, secuencias en extremos.
Su excisión del genoma es inducible a 42ºC.
 Todo el concepto de fusión genetica se asocia al fago mu, revoquémonos a la época
cuando no existía el PCR ni las enzimas de restricción, entonces la forma de poner un gen
contiguo al otro es mediante la recombinación, pero cuando uno no tiene zonas de homología y
quiero poner juntos por ejemplo X y Z la forma de hacerlo es con zonas de homología pero si
no las tengo, las puedo crear con Fago Mu. Porque si yo puedo crear fácil una mutante de lo
que sea, puedo crear esa zona de homología.
Normalmente el argumento era poner contiguo al gen lacZ para usarlo de reportero.
(por ejemplo, para estudiar expresión apartir de un promotor especifico) También se puede usar
las propiedades de lacZ para purificar la proteína, como se usó cuando se estudió las proteínas
de la secreción (secB).
Si uno quiere poner lacZ alado de cualquier proteína se puede crear esta zona de
homología con fago Mu y realizar la fusión. Se requiere ademas un vector, un lambda
tranductante de transducción especializada, que no nos contó como se fabricó, básicamente es
un pedacito de fago mu y proteína lacZ. Entonces si yo quiero poner en el gen X fusionado a
lacZ primero tengo que hacer una mutante de X por fago Mu y eso es hacer una infección, ver
los sobrevientes que tengan una mutación lacZ- y tiene que ser a 30º porque lo estoy haciendo
con el fago termosensible. Si yo estoy usando como reportero lacZ el huésped tiene que ser
deleción de operon lac. Usando el lambda transductante uno infecta, y si se produce la
recombinación, se va a tener la fusión de fago Mu, lacZ y lambda transductante. Pero aquí uno
no tiene la proteína fusionada, asique si se induce a 42ºC Mu va a saltar y esto ocurre también
espontáneamente, al escindirse se lleva pedacitos de izquierda y derecha creando esta fusión
de X y lacZ. Esto ocurre con cierta frecuencia sin que ocurra ciclo lítico, pero como me doy
cuenta yo de que estos clones tienen la proteína de fusión, primero plaquear los sobrevivientes
y luego inducir, porque si induzco a fago Mu la huésped se va a morir, pero aquellas que ya
habían hecho la excisión van a vivir. Pero más aun, lo que se excinda y quede en el marco de
lectura correcto de lacZ, van a ser las únicas que crecerán en el plaqueo a 42ºC y medio con
gal, es decir, serán las únicas que sean las proteínas de fusión.

Existe también la posibilidad de hacer clonamiento in vivo por fago mu en vez de hacer
las genotecas con fago lambda. Por ejemplo, aca se puede tener representada una genoteca
también y se basa en un derivado del fago mu, el fago mud5005. La gracia es que este
plasmidio tiene una resistencia para un antibiotico. En este caso …y puta la wea no entendi
nada mas sorry.

FIN