Genetica Microbiana

Facultad de Ciencias Naturales y Matemática
Curso: Genética Microbiana
Tema 6 : Clonamiento en bacterias
BSc. PAUL ANTONIO FERNANDEZ CASTRO
- Universidad Nacional Federico Villareal (UNFV), Peru.

- MSc.(c)–Maestría en Biología Molecular – Universidad Nacional Mayor de San Marcos
(UNMSM).
- Asistente de Investigación en Instituto Nacional de Salud. Lab. de Virus Respiratorios.
2021
Universidad Nacional
Federico Villarreal Facultad de Ciencias
Naturales y Matemática
En cada caso, clon = conjunto de elementos genéticamente idénticos (entre sí y al

elemento precursor).
Diversos descubrimientos científicos han sido de crucial importancia para el

desarrollo de la tecnología de DNA recombinante, cuya técnica original la
presentaron Cohen y Boyer en 1974. Los elementos participantes en la clonación
molecular son:
a) plásmidos, moléculas circulares de DNA capaces de replicarse dentro de una

bacteria de manera independiente de su genoma.
b) Inserto, DNA de interés.
c) enzimas de restricción, endonucleasas que cortan el DNA en secuencias
específicas.
d) ligasa de DNA, enzima capaz de unir por sus extremos dos fragmentos de DNA,
lo que permite la formación de un DNA circular.
e) proceso de transformación, introducción del DNA recombinante manipulado in
vitro en una célula hospedadora para su propagación, identifi cación y
aislamiento.
Federico Villarreal
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN
Poseen la capacidad única de cortar ambas hebras del DNA de doble cadena en sitios
específicos. La especificidad de estas enzimas está determinada por la secuencia de
nucleótidos del DNA, llamada secuencia de reconocimiento, que identifica en torno al sitio
de corte, y que va por lo general de cuatro a seis pares de nucleótidos.
Una endonucleasa de restricción hace posible cortar una molécula de DNA en un sitio
preciso. Las secuencias de reconocimiento son Palindrómicas, es decir, se leen de la
misma manera en sentido 3′-5′ que en sentido inverso en la hebra complementaria.
La ADN ligasa
Las técnicas de DNA recombinante permiten insertar y expresar, en el genoma

de un ser vivo, pequeños fragmentos de DNA ajenos al mismo. En la mayor parte
de los experimentos, las células hospedadoras son bacterias.
Hay dos razones principales para usar bacterias en estas metodologías debido a:
1) la relativa simplicidad para producir mRNA maduro y su proteína
correspondiente, comparado con un sistema eucarionte.
2) la capacidad de las bacterias para multiplicarse de manera exponencial en
periodos muy cortos, con lo cual es posible obtener grandes cantidades del DNA
o de la proteína de interés.
La bacteria utilizada con más frecuencia para este propósito es Escherichia coli.
GENOTECAS
Las genotecas pueden ser de dos tipos, lo cual depende de que los fragmentos de
DNA que las componen representen directamente el genoma del ser vivo o a la
población de mRNA presente tanto en un tejido como en un momento del desarrollo
determinado.
DATOS:
- Genotecas de genomas eucariontes presentan diversos problemas (presencia de

intrones y secuencias reguladoras).
- La genoteca es una recolección de DNA complementarios (cDNA) (copias de
mRNA en forma de DNA), que se propagan en un vector de clonación.
Las Genotecas pueden generarse de diversas formas y en diferentes vectores.

VECTORES DE CLONACIÓN
Los vectores de clonación llevan el DNA extraño (normalmente plásmidos),
además son diversos y deben reunir ciertas características:
- poseer un origen de replicación (que les da la capacidad para ser replicados de

manera independiente del genoma de la célula que los contenga).
- Tener un marca(secuencias de corte identificables por endonucleasas de
restricción específicas) compatibles que permita identificar las células que lo
contengan.
- Sitios de restricción con los que estén en el fragmento a insertar.
- Tener un mecanismo de incorporación a la célula hospedadora
una vez construidos (cuadro 8-2).
- Insertos de hasta 15kb de longitud.
- 1,000 bp a 100 kb
Eejemplo:
pBR322 (generado por ingeniería genética)

- 2 genes antibióticos.
- solo 10-50 copias/célula
Propiedades que un Vector Bacteriano debe tener:
1. Capaz de replicarse:
• replicarse de manera autónoma (su propio origen de replicación)
• extracromosómico al cromosoma del huesped
2. Marcadores de selección:
• normalmente resistencia a antibiótico en E. coli
• actividad B-galoctosidasa
3. Sitios de restricción únicos:
• sitio presente sólo una vez en el plásmido
• al linearizar el fragmento puede ser clonado
4. Alto número de copias si es posible:
• 1-50 copias (mientras más mejor)
CLONACIÓN
El procedimiento de Clonación de un gen o fragmento de DNA es una técnica en la
que una secuencia de DNA es introducida en un virus o bacteria, los cuales son
cultivados en condiciones que propicien su máximo crecimiento y tiene básicamente
los siguientes pasos:
1) El aislamiento inicial o síntesis del fragmento de DNA de interés.

2) El acoplamiento de esta secuencia a un vehículo o vector portador, entendiendo
por vector a una molécula de DNA que es capaz de replicarse de modo
independiente del genoma dentro de un sistema celular.
3) La incorporación del complejo vector-DNA en la célula hospedadora,
procedimiento denominado transformación.
4) La expresión del DNA en la célula hospedadora.
La técnica de Clonación depende de un grupo de enzimas de restricción

endonucleasas obtenidas de bacterias.
Para clonar una secuencia, tanto el DNA de interés como el Plásmido que se utilizará
como vector son digeridos con una Endonucleasa de Restricción, generando
fragmentos compatibles.
En caso de la clonación de secuencias para inducir su expresión, cuando se introduce

el vector con el inserto en las células donde se expresará, éstas mantendrán
reprimida o inactiva la transcripción hasta que se añada al medio una sustancia
inductora que active al promotor.
PROCEDIMIENTO
1. Preparación del DNA

NOTA:
A tener en cuenta que el DNA incluye una gran proporción de secuencia no codificante
(intrones) insertada entre la secuencia codificante (exones).
Si un fragmento de DNA de tales características fuera insertado y transcrito de manera
directa en un sistema bacteriano, la bacteria no sería capaz de procesar el mRNA precursor
inmaduro y no ocurriría la síntesis de la proteína correspondiente, debido a que no posee la
maquinaria enzimática necesaria.
Es necesario incorporar a éste la secuencia definitiva del mRNA, en forma de secuencia de

DNA (cDNA), a partir de la cual la bacteria sería capaz de transcribir el mensajero adecuado
e incluso traducirlo en la proteína correspondiente; con ayuda de una enzima Transcriptasa
Inversa.
Una vez obtenido el cDNA, es necesaria la síntesis de la cadena complementaria

(segunda cadena), separando al cDNA del mRNA original, el cual es digerido, y
procediendo a la síntesis de la segunda cadena mediante una enzima polimerasa de DNA,
con lo que se obtiene un cDNA de doble cadena representativo de los mRNA originales, el
cual puede ser incorporado al sistema bacteriano mediante su inserción en un vector
adecuado.
Ejemplo: construcción de un plásmido recombinante

2. Construcción del Plásmido o complejo de DNA vector-insertos.
Una vez producido el DNA a clonar, es necesario incorporarlo a un sistema en el cual pueda ser
expresado. Esto implica la inserción del fragmento en cuestión en un vector, para lo cual es
indispensable la elaboración de un mapa de restricción, que permita localizar el número y la
posición de los sitios de corte de las endonucleasas que se utilizarán.
Los vectores usados más a menudo son plásmidos bacterianos, es decir, pequeños DNA
circulares que no forman parte del genoma bacteriano y que son capaces de replicarse de
manera autónoma a éste.
3. Transformación
Una vez que el complejo vector-inserto se ha formado, debe incorporarse a una bacteria.
Este procedimiento se denomina Transformación. El mecanismo preciso de cómo ocurre
la incorporación de dicho complejo a través de la membrana bacteriana aún no es
completamente conocido.
Sin embargo, se sabe que comprende un cambio transiente en la permeabilidad de la

membrana, y que es un proceso lento y poco eficiente, por lo que una vez realizado
deben determinarse cuidadosamente cuáles bacterias han incorporado el plásmido y
cuáles no.
4. Expresión del DNA clonado en un sistema bacteriano.
Para lograr que el DNA clonado se exprese en un sistema bacteriano, es necesario tomar en
cuenta ciertos aspectos adicionales:
- El DNA a expresar debe ser clonado en un plásmido (vector) reconocible por la enzima
encargada de la producción de mRNA mediante la Transcripción.
- Son dos los sitios de reconocimiento específico necesarios para la expresión del DNA en
un sistema bacteriano:
▪ El Promotor, que es el sitio donde la ARN polimerasa encargada de la Transcripción se

une, y el sitio de unión del ribosoma. Este sitio debe estar presente en el mRNA para
permitir su unión al ribosoma y su Traducción a proteína.
Por su parte, la eficiencia del proceso de expresión dependerá de varios factores:

▪ el número de copias de plásmido por célula.
▪ la eficiencia del promotor.
▪ el índice de frecuencia de uso de codones.
▪ la estabilidad o vida media del mRNA.
▪ El nivel de proteólisis de la célula hospedadora.
IDENTIFICAR TRANSFORMANTES
Select for White colonies on Ampicillin (AmpR) and X-gal plates (LacZ- )
APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

- Producción, en gran escala, de sustancias de importancia clínica (Insulina e Interferón).
- Entre la causa de muchas enfermedades, como la anemia falciforme, la enfermedad de
Tay-Sachs, y otras, está un defecto en un solo gen.
- Descubrimiento de las secuencias espaciadoras (intrones) en el DNA de los seres vivos
multicelulares.
INDUSTRIA FARMACÉUTICA Y SALUD

- Determinados genes víricos potencialmente importantes se han
aislado del genoma vírico, mutado hasta destruir su actividad y, a
continuación, reinsertados para saber si el producto génico es
esencial para la patogenicidad.
MEDICINA FORENSE
- La determinación de las huellas dactilares genéticas constituye otra
aplicación de las técnicas moleculares, de modo específi co la PCR y las
enzimas de restricción.
INDUSTRIA ALIMENTARIA
- En levaduras, la producción de nuevas cepas con crecimiento rápido y alto
rendimiento tiene un valor potencial; en la elaboración del pan, se han
conseguido nuevas cepas de crecimiento rápido y con buena producción
de dióxido de carbono.
- En la industria de bebidas se han provisto ciertos cambios, mediante el
clonado de levaduras en muchas enzimas, para la producción de cervezas
más ligeras gracias a la actividad más eficiente de la amilasa
PLANTAS
- Agrobacterium tumefasciens. Esta bacteria ha podido hacer plantas transgénicas
desde hace millones de años invadiendo la planta e introduciendo un segmento de
DNA, llamado plásmido Ti, desarrollando un tumor.
- En los últimos años, se han establecido mecanismos para transformar y regenerar
plantas mediante biobalística. Con esta técnica, el DNA se hace penetrar a las células,
atravesando la pared celular, mediante múltiples disparos con balas microscópicas
que llevan los genes y los insertan en el tejido vegetal.
VACUNAS
- Ayudados de las técnicas de biología molecular, existe la posibilidad de
clonar y expresar en bacterias los genes de las proteínas de la envoltura
vírica, utilizando el producto bacteriano como vacuna.
BioNTech BNT162 COVID-19 Vaccine

Puntos más importantes:
- La Clonación de ADN es una técnica de biología molecular que hace

muchas copias idénticas de un fragmento de ADN, como un gen.
- En un experimento típico de clonación, se inserta un gen blanco en un
fragmento circular de ADN llamado plásmido.
- El Plásmido se introduce en bacterias mediante un proceso
llamado transformación y las bacterias que contengan el plásmido se
seleccionan mediante antibióticos.
- Las bacterias con el plásmido correcto se utilizan para hacer más ADN
plasmídico o, en algunos casos, se induce la expresión del gen para
hacer proteína.
Los pasos de la clonación de ADN
La clonación de ADN se utiliza para muchos propósitos. Como

ejemplo, veamos cómo la clonación de ADN se puede utilizar para
sintetizar una proteína (como la insulina humana) en bacterias. Los
pasos básicos son:
1.Abrir el plásmido y "pegar" el gen dentro. Este proceso depende

de enzimas de restricción (que cortan el ADN) y de ADN ligasa (que
une el ADN).
2. Insertar el plásmido en las bacterias. Se usa selección con

antibióticos para identificar las bacterias que incorporaron el
plásmido.
3. Cultivar bacterias portadoras de plásmido en gran cantidad y

usarlas como "fábricas" para producir la proteína. Recolectar la
proteína de las bacterias y purificarla.
PREGUNTAS
Un científico construye un plásmido recombinante bacteriano que contiene un gen que

confiere resistencia al antibiótico kanamicina (kan). El científico transforma cultivos de la
bacteria E. coli con el plásmido recombinante, y luego incuba los cultivos durante una noche
en placas que contienen medio sin kanamicina (kan-) y con kanamicina (kan+).
Si asumimos que el protocolo de transformación fue exitoso, ¿cuál de los siguientes predice
mejor el patrón de crecimiento bacteriano que se espera después del período de
incubación?
El mamut lanudo es un pariente extinto de los elefantes modernos. Los científicos han
descubierto una cantidad de especímenes de mamut lanudo preservados en el permafrost
del ártico, y han extraído ADN de los tallos pilosos de esto animales. Este ADN se ha
estudiado en el laboratorio con las mismas técnicas utilizadas para estudiar el ADN de los
organismos de hoy en día.
Por ejemplo, un grupo de científicos usó una muestra de ADN de mamut lanudo para
secuenciar el genoma nuclear del animal. Primero, los científicos recortaron el ADN muestra
en fragmentos. Luego, amplificaron los fragmentos para secuenciarlos. Después de la
secuenciación, los científicos usaron computadoras para volver a ensamblar las secuencias de
los fragmentos para determinar el orden de los nucleótidos en el genoma del mamut.
¿Cuál de la siguientes técnicas podría lograr el paso de amplificación del proceso de los
científicos?
La queratitis amebiana es una infección rara del ojo asociada con el uso de lentes de contacto blandos. La
infección suele ocurrir cuando cierto tipo de amebas penetran el ojo por el uso de lentes de contacto
contaminados.
Investigadores médicos han usado la digestión por enzimas de restricción para caracterizar el tipo de ameba
que se encuentra en los pacientes con queratitis amebiana. Estos investigadores extrajeron el ADN
mitocondrial de las amebas causantes de la infección y dirigieron, o recortaron, el ADN con una enzima de
restricción. Cuando observaron las muestras de ADN resultantes mediante electroforesis en gel, encontraron
cinco bandas de los siguientes tamaños: cerca de 4,200 pares de bases (pb), 5,500 pb, 6,500 pb, 9,300 pb, y
10,500 pb.
Para determinar la prevalencia de las amebas causantes de infección en una región específica, los
investigadores obtuvieron muestras de estuches de lentes de contacto en un conjunto representativo de
hogares. Los investigadores aislaron las amebas presentes en cada muestra y luego usaron el protocolo
descrito anteriormente para observar los patrones de bandas de ADN del ADN digerido de las amebas
(Figura 1).
Figura 1. Electroforesis en gel del ADN de

ameba digerido por enzimas de
restricción. Los primeros cuatro carriles
contienen ADN mitocondrial digerido de
las muestras de ameba 1-4. El carril 5
contiene una escalera de ADN para
comparación de tamaño. Se señala el
tamaño de cuatro bandas (pb = pares de
bases).
De acuerdo con los datos de la Figura 1, ¿Qué muestra proviene de amebas que pueden causar
queratitis amebiana?
Gracias…
MUTAGÉNESIS
¿Qué son las mutaciones?
Los cambios en la secuencia del ADN son mutaciones.
ATGCGTTC
TACGCAAG
ATG A GTTC
TACGCAAG
Terminator
Promotor Región de codificación
¿Cuáles son los efectos de las mutaciones?
¿Todas las mutaciones cambian el genotipo?
¿Todas las mutaciones cambian el fenotipo?
¿Cuáles son algunos fenotipos de bacterias?

Algunos fundamentos de la genética bacteriana
El ADN bacteriano (como cualquier ADN) puede ser alterado por

mutaciones
Las mutaciones pueden provocar cambios en las proteínas.
diversidad
adquisición de resistencia
Se pueden transmitir nuevos rasgos a otros

microbios.
¿Qué sucede cuando se muta el ADN?
Las bases (nucleótidos) se cambian (base

sustitución)
Las bases se insertan o eliminan
Las secuencias de ADN se mueven alrededor del genoma

(transposones)
Mutación puntual: se cambia un solo aminoácido
¿Cuántos aminoácidos se modifican?
Mutación
• Sustitución de base • Cambio en una base Da

(mutación puntual) como resultado un cambio
en el aminoácido
• Mutación sin sentido
Figura 8.17a, b
Mutación
• Sustitución de bases • resultado

Da como una
(mutación puntual) codón sin sentido
• Mutación sin sentido
Figura 8.17a, c
Mutación
• Inserción o eliminación de
• Mutación con desplazamiento de la pauta de lectura
uno o más pares de
nucleótidos
Figura 8.17a, d
06_22_DNA discordancia.jpg
La célula tiene un mecanismo para
identificar la síntesis de nuevas
cadenas mediante
partida mellas ese ADN. Hay

enzimas que escanean estas
nuevas regiones en busca de
errores.
¿Qué causa las mutaciones?
Mutaciones espontáneas Errores en la replicación
Mutaciones inducidas Causado por un mutágeno
Mutágenos: químicos, físicos

Mutaciones espontáneas
• ¿Cuáles son algunas de las causas de las mutaciones espontáneas? (Replicación del ADN así
como durante las fases G del ciclo celular)
• ¿Cuál es la tasa de mutación espontánea por gen por generación para
eucariotas? (10- 4 hasta 4 x10- 6 por gen por generación)
• ¿Cómo mantiene la célula esta tasa tan baja? (Polimerasas de reparación y
autocorrección del ADN)
• ¿Qué tipos de mutaciones pueden resultar de errores de replicación por la ADN
polimerasa y durante qué fase del ciclo celular puede suceder esto?
• ¿Cuáles son las fuentes más comunes de mutaciones espontáneas y cuáles son
las consecuencias directas de tales cambios?
• Hacer un bucle fuera del ADN / omitir el pol de ADN
• Depuración química, desaminación,
• Describe una mutación puntual que se encuentra con mayor frecuencia en los "puntos calientes
mutacionales" de un genoma.
• La citosina metilada se desamina para producir una timina (este cambio NO es detectado por
los sistemas de reparación)
Las bases son
Normalmente
En el ceto
Forma — si está en
La forma enol;
Base par
incorrectamente
Figura 7.6 Emparejamiento normal de bases Watson-Crick y no Watson-Crick en el ADN. ( a) Emparejamiento normal de bases
Watson-Crick entre las formas normales de T y A y de C y G. ( B) Emparejamiento de bases no Watson-Crick entre formas
normales de pirimidinas y formas tautoméricas raras de purinas. ( C) Emparejamiento de bases distintas de Watson-Crick entre
formas tautoméricas raras de pirimidinas y formas normales de purinas.
Figura 7.7 Producción de una mutación como resultado de un desajuste
causado por el apareamiento de bases oscilantes. Los detalles se explican
en el texto.
Figura 7.7 Producción de una mutación como resultado de un desajuste
causado por el apareamiento de bases oscilantes. Los detalles se explican
en el texto.
Espontáneo
Químico
Cambios
Figura 7.9 (a) Desaminación de citosina a uracilo. (b)

Desaminación de 5-metilcitosina (5mC) a timina.
Las mutaciones pueden ocurrir espontáneamente o pueden
ser inducido
Por productos químicos
Por radiación
Mutaciones inducidas
• ¿Cuáles son algunos ejemplos de mutágenos físicos? (radiación o productos químicos)

• ¿Por qué los tipos de mutaciones son diferentes cuando son causadas por la luz ultravioleta, en
comparación con la radiación ionizante? (la ionización produce iones que rompen enlaces covalentes (p. ej.,
estructura de azúcar-fosfato; el efecto es acumulativo) (los anillos absorben la luz ultravioleta y cambian
químicamente para formar dímeros TT)
• ¿Cuáles son las consecuencias directas de la formación de un dímero de timina? (protuberancia en el ADN)
• ¿Cuáles son las 3 clases generales de mutágenos químicos?
• (análogos de base, modificadores de base e intercalantes)
• ¿En qué partes del ciclo celular se manifiestan estas diferentes clases de mutágenos? (análogos de base
y trabajo de intercalación durante la replicación; modificación de base en cualquier momento)
• ¿Qué tipo de mutación inducen los análogos de bases? (tomar el lugar de la base; causar
transiciones)
• ¿Qué otros tipos de interrupciones puede producir un efecto analógico básico? ¿Cuál es un ejemplo de esto y
cómo se usa con fines medicinales? AZT es un análogo de T (detiene la replicación)
• ¿Cuáles son los 3 tipos de agentes modificadores de bases que causan mutaciones y cuáles son sus
efectos directos? (desaminación, hidroxilación, alquilación)
Vista de nivel molecular
Recuerda que estos son eventos aleatorios
Vista de nivel de ADN de los mismos dos eventos que la última diapositiva
La radiación puede provocar mutaciones
Efectos de la radiación ultravioleta
Dímeros de timina
Árbitro.
Emparejamiento de bases en
hebra opuesta hace

no ocurrió
Saltos de polimerasa
durante la replicación
Afortunadamente estos
están reparados
Efecto de los rayos UV sobre la estructura del ADN
http://whyfiles.news.wisc.edu/173skin_cancer/2.html
Los fotones aleatorios de luz ultravioleta (UV) inducen
enlaces aberrantes entre vecinos pirimidinas
(timina y citosina) se basa en la misma cadena de
ADN. Evitará que la máquina de replicación duplique
el ADN. ¡La celda morirá!
Este tipo de defecto se puede revertir fácilmente mediante un proceso

llamado fotorreactivación . La energía de la luz visible se usa para revertir
el defecto (en bacterias, levaduras, protistas, algunas plantas y algunos
animales, pero NO en humanos)
Radiación ionizante
Cualquier radiación capaz de desplazar electrones de

átomos o moléculas, produciendo iones.
Algunos ejemplos son los rayos alfa, beta, gamma y X.
Provoca la formación de radicales libres y oxígeno tóxico.
Provoca roturas en la columna vertebral del fosfodiéster, el

ADN no se puede replicar a menos que se repare
• Agentes intercalantes La proflavina, la acridina y el
bromuro de etidio se insertan entre bases adyacentes
en una o ambas hebras de la doble hélice de ADN, lo
que hace que se relaje.
• Durante la replicación, se debe insertar una base adicional frente al
agente (adición)
• Si se inserta en el nuevo ADN en lugar de una base, cuando el ADN
se replica, el agente se pierde, lo que resulta en una eliminación.
• Mutagénesis específica del sitio - in vitro generación de

mutaciones específicas
Mutaciones intercaladas (por ejemplo, EtBr)
http://amiga1.med.miami.edu/Medical/Werner/Images/Lecture4/Mutation%20types.JPG
Palabras que describen cambios fenotípicos.
Mutación silenciosa: sin cambios en el fenotipo
Mutación letal: las células mueren
Mutación condicional: fenotipo expresado solo

bajo ciertas condiciones ambientales.
Mutaciones sensibles a la temperatura
Auxotroph - mutación en un gen anabólico que hace que una

célula requiera un aminoácido, nucleótido o vitamina en el
medio ambiente
Resistencia - provoca resistencia a un desafío medioambiental
Virus, antibióticos, metales.

Nombrar proteínas, genes, mutantes y
Mutaciones
Para bacterias
Genotipo Gene- trpA Proteína- TrpA
Fenotipo Trp + o Trp -
Los mutantes serían designados trpA1, trpA2

Usos de la mutagénesis
• Definir el papel de un gen: ¿los fenotipos se

alteran por mutaciones?
• Determinar regiones funcionalmente importantes de
un gen ( en vivo o in vitro)
• Mejorar o cambiar la función de un producto
genético.
• Investigar funciones de no genes, p. Ej. Regiones de
ADN importantes para la regulación
Enzimas: cultivos comerciales biotecnológicos
Obtención de enzimas útiles
De Koeller y Wang, "enzimas para síntesis química", Nature 409, 232 - 240 (2001)
Mutagénesis aleatoria
• Mutagénesis de casete con oligos "dopados"

• Mutagénesis química
• exponer un fragmento corto de ADN al mutágeno, hacer una "biblioteca" de
clones, realizar pruebas de fenotipos
• Mutagénesis por PCR por incorporación errónea de bases

• Incluir Mn 2+ en reacción
• Reducir la concentración de un dNTP
Mutagénesis aleatoria por
PCR: la proteína verde
fluorescente
Mutantes de pantalla
Mutagénesis de casete (semi-
aleatorio)
Traducción de secuencia
Hebras sintetizadas individualmente, luego recocidas
Permite la inserción aleatoria de cualquier aminoácido en posiciones

definidas
Mutagénesis aleatoria y semialeatoria:
evolución dirigida
• Mutagenizar la proteína existente, p. Ej. PCR propensa a

errores, mutagénesis de casete de oligo dopado
--y/o-
Hacer "mezcla de genes"
(Crea biblioteca)
• Biblioteca de pantallas de mutaciones para proteínas con

propiedades alteradas
• Detección estándar: 10,000 - 100,000 mutantes
• Visualización de fagos: 10 9 mutantes
Mezcla de genes: "PCR sexual"
Mutagénesis dirigida al sitio:
método de extensión del cebador
Inconvenientes:
- - tanto las versiones mutantes como

las de tipo salvaje del gen se producen
después de la transfección - muchas
Se requiere cribado, o se requieren

trucos para prevenir la replicación de la
hebra de tipo salvaje
- - requiere monocatenario,
ADN de plantilla circular
Extensión de cebador alternativa
técnicas de mutagénesis
"QuikChange TM "Protocolo
Destruye el
plantilla de ADN
(El ADN tiene que
viene de
presa + anfitrión
Ventaja: puede utilizar ADN plasmídico (de doble hebra)

Primera PCR
Dirigido al sitio
mutagénesis:
A
Mega-imprimación
método
Segundo PCR
Plantilla de tipo salvaje
B
El megaprimer debe
purificarse antes de la PCR 2
Permite la colocación de
mutación en cualquier parte de un
Intercambio de dominios mediante "megaprimers" (PCR
superpuesto)
NORTE- -C
Plantilla 1
PCR 1
Mega-imprimación
Plantilla 2
PCR 2
Se han intercambiado los dominios

Mutagénesis por deleción mediada por PCR
ADN objetivo
Productos de PCR
El diseño de oligonucleótidos permite precisión en las posiciones de deleción

Mutagénesis dirigida
• Realizar cambios en la secuencia de aminoácidos basados en

decisiones racionales.
• Estructura conocida? Mutar los aminoácidos en cualquier
parte de la proteína que se cree que influye
actividad / estabilidad / solubilidad, etc.
• ¿Proteína con varios miembros de la familia? Mutar la
proteína deseada en posiciones que la acerquen a otro
miembro de la familia con las propiedades deseadas.
Descargado de http://cshprotocols.cshlp.org/ el 18 de enero de 2018 - Publicado por
Prensa de laboratorio Cold Spring Harbor
Introducción al tema
Clonación recombinacional de puerta de enlace
John S. Reece-Hoyes y Albertha JM Walhout
El sistema de clonación recombinante Gateway se desarrolló para clonar múltiples fragmentos de ADN en paralelo
(por ejemplo, en formatos de 96 pocillos) de una manera estandarizada utilizando las mismas enzimas. La clonación de
la puerta de enlace se basa en fi c reacciones de integración y escisión de bacteriófagos λ dentro y fuera del
Escherichia coli genoma. Debido a que los sitios de recombinación ( " att " sitios) son mucho más largos (25 - 242 pb) que los sitios
de restricción, es extremadamente improbable que ocurran por casualidad en los fragmentos de ADN. Por lo tanto, se puede
usar la misma enzima de recombinación para clonar de manera robusta muchos fragmentos diferentes de tamaño variable en
reacciones paralelas.
PRINCIPIOS GENERALES DE CLONACIÓN
Muchos enfoques experimentales utilizan construcciones informadoras para ayudar a comprender la expresión y
función de las proteínas. Normalmente, estas construcciones son vectores plasmídicos diseñados para expresar una
proteína informadora que indica la expresión espacio-temporal y / o la función de una proteína de interés. Una
proteína informadora puede expresarse sola bajo el control exclusivo de una secuencia de ADN reguladora de interés,
o puede unirse en una fusión de traducción a una proteína de interés. Una proteína reportera puede ser una fl proteína
fluorescente que se puede visualizar (por ejemplo, el verde fl proteína fluorescente, GFP), una enzima cuya actividad se
puede determinar (por ejemplo, luciferasa), o una etiqueta que trae una especificación fi c propiedad bioquímica de la
fusión (p. ej., glutatión- S- transferasa, GST). Por ejemplo, una construcción en la que GFP se fusiona con una proteína de
interés, con su expresión controlada por el promotor del gen correspondiente, puede mostrar dónde y cuándo se
expresa la proteína endógena observando el patrón de expresión de GFP.
Las construcciones informadoras se realizan típicamente transfiriendo la secuencia insertada - un marco de lectura abierto
(ORF) y / o un fragmento de ADN regulador (por ejemplo, un promotor) - en un plásmido que codifica la proteína informadora, de
modo que el ORF comparte el marco de lectura del informador. Los métodos de clonación convencionales usan endonucleasas
de restricción para generar tanto el esqueleto del vector como el inserto (s) con extremos compatibles para que puedan unirse
para formar un plásmido circular, usando ADN ligasa. De esta manera, la creación de construcciones está limitada por la
presencia o ausencia de sitios de digestión apropiados tanto en el fragmento de ADN como en el vector, y es muy poco
probable que dos construcciones informadoras cualesquiera utilicen la misma combinación de enzimas de restricción. Estos
factores hacen que la generación de más de unas pocas construcciones informadoras diferentes utilizando la clonación
convencional sea un desafío y la generación de colecciones de todo el genoma para una investigación de alto rendimiento sea
imposible.
PRINCIPIOS BÁSICOS Y APLICACIONES DE LA CLONACIÓN DE GATEWAY
El sistema de clonación recombinante Gateway se desarrolló para clonar múltiples fragmentos de ADN en paralelo (por
ejemplo, en formatos de 96 pocillos) de una manera estandarizada utilizando las mismas enzimas (Hartley et al.
De la colección Molecular Cloning, editada por Michael R. Green y Joseph Sambrook.
© 2018 Cold Spring Harbor Laboratory Press Cite esta introducción como Protocolos de Harb de
Cold Spring; doi: 10.1101 / pdb.top094912
1
JS Reece-Hoyes y AJM Walhout
2000; Walhout y col. 2000; Reboul y col. 2001). La clonación de la puerta de enlace se basa en fi c reacciones de
integración y escisión de bacteriófagos λ dentro y fuera del Escherichia coli genoma (Hartley et al. 2000). El sistema de
clonación Gateway utiliza dos mezclas de enzimas diferentes, cada una de las cuales realiza un tipo diferente de
reacción de recombinación. La mezcla de enzimas BP clonasa se recombina att Sitios B con att Sitios P, generando att Tierra
att Sitios R; mientras que la mezcla de enzimas LR clonasa cataliza la reacción inversa (Fig. 1A). Cada evento de
recombinación es preciso, sin que se ganen ni se pierdan nucleótidos. Reconocimiento de att sitios es extremadamente
específico fi c (es decir, las enzimas clonasas de BP nunca usan att L o att Sitios R), por lo que cada reacción de
recombinación genera solo un conjunto de derivados. Los cuatro tipos de att los sitios se diferencian por la presencia /
ausencia de " brazos "( Fig. 1B) a cada lado de un núcleo de 25 pb " región de reconocimiento. "
Los brazos contienen sitios de interacción para las enzimas de recombinación. Dentro de la región de reconocimiento hay un
7-bp " superposición asimétrica " ese es el sitio en el que el ADN se corta y se vuelve a unir (Fig. 1C). La introducción de cambios
de nucleótidos dentro de la región de reconocimiento de 25 pb (Fig. 1C) se ha utilizado para diseñar diferentes subtipos de att sitios
que se recombinan solo entre sí (es decir, att Sitios B1 con att Sitios P1, pero no con
att P2 o att Sitios P3). Estos diferentes conjuntos de att Los sitios facilitan la clonación de cada fragmento de ADN en una
sola orientación (Fig.2) en cada vector (p. ej., colocando un att Sitio B en cualquier extremo).
Para cada fragmento de ADN de interés (p. Ej., Promotor, ORF, 3 ′ UTR), un " Clon de entrada " es fi generado por una
reacción de clonación de BP Gateway en un " Vector de donante "( Figura 2). Normalmente, el fragmento de ADN que
contiene el ORF o la secuencia reguladora es inicialmente ampli fi ed por PCR utilizando cebadores de cola larga (~ 50
pb) con los 3 ′ parte de los primers speci fi c para el ADN de interés y el 5 ′ cola de los cebadores que contienen los att Sitios
B. Este producto de PCR luego se transfiere a un vector donante con compatibilidad att Sitios P. El fragmento de ADN en
un clon de entrada ahora está disponible para su transferencia a muchos tipos de " Vectores de destino " mediante una
reacción de clonación Gateway LR (Fig. 3). Es importante destacar que los cebadores utilizados inicialmente para clonar
cada ORF pueden diseñarse para eliminar los codones de inicio / parada endógenos y para coincidir con el marco de
lectura utilizado por todos los vectores de destino que expresan proteínas de fusión amino-terminales o
carboxi-terminales. Este marco de lectura no cambia por las transferencias entre vectores porque las recombinaciones
de Gateway son precisas. Más avanzado " multisitio " Las reacciones Gateway LR pueden usarse para incorporar los
fragmentos de ADN de más de un clon de entrada (por ejemplo, promotor y ORF) en una única construcción de destino
(Fig. 4). Este enfoque es extremadamente útil para generar construcciones complejas, en las que, por ejemplo, un
promotor y un ORF se fusionan en un ORF que codifica GFP.
Para seleccionar el producto de recombinación deseado, todos los vectores de entrada y destino contienen
un " Casete de puerta de enlace " así como diferentes genes de resistencia a antibióticos. El casete Gateway
contiene un gen de resistencia al cloranfenicol y el ccdB gen (Bernard y Couturier 1992; Miki et al. 1992) que
confiere letalidad a los E. coli cepas (p. ej., DH5 α). El evento de recombinación intercambia el fragmento de ADN
de interés con el casete Gateway, lo que permite el crecimiento de DH5 α bacterias en medios que contienen el
antibiótico requerido (p. ej., kanamicina para clones de entrada, ampicilina para
A Reacción de BP: att B × att PAG → att L + att R C att B0 TCAAGTTAGTATAAAAAAGCAGGCT

Reacción LR: att L × att R → att B + att PAG att B1 ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
att B2 ACAAGTTTGTACAACAAAGCTGGGT
att B4 CAACTTTGTATAGAAAAGTTG
B att PAG
att B
att L
att R
FIGURA 1. Generando un clon de Entry usando una reacción Gateway BP. ( A) Una reacción Gateway BP usa enzimas clonasas BP
para recombinar un att Sitio P con un att B para generar un att L sitio y un att Sitio R, mientras que la clonasa LR realiza la
recombinación inversa. ( B) att PAG, att Tierra att Los sitios R tienen reconocimiento " brazos " en uno o ambos lados del
" región de reconocimiento "( caja con punta de flecha), mientras que att Los sitios B no tienen brazos. Estos brazos contienen sitios de unión para las
enzimas de recombinación y se denominan " izquierda " y " derecho " con respecto a la superposición asimétrica: att Los sitios L tienen un brazo5 ′ ( o
izquierda) de la superposición (cuadro blanco), att Los sitios R tienen un brazo3 ′ ( o derecha, caja azul), y att Los sitios P tienen ambos brazos. ( C) att Los
sitios B tienen ~ 25 pb y cuentan con una central de 7 pb " superposición asimétrica "( en caja) que determina dónde se corta y se vuelve a unir el ADN.
att B0 es el sitio que ocurre naturalmente en el E. coli genoma que es utilizado por bacteriófagos λ ( Hartley y col. 2000). La mutagénesis se ha
utilizado para generar las otras variedades de att Sitios B.
2 Cite esta introducción como Protocolos de Harb de Cold Spring; doi: 10.1101 / pdb.top094912
Promotor B4-B1R B1-ORF-B2

Producto de PCR Producto de PCR
B4 B1R B1 B2
Promotor ORF
X X X X
Casete de puerta de enlace Casete de puerta de enlace
P4 P1R P1 P2
pDONR P4-P1R Propagar en DB3.1 pDONR 221
bacterias.
Kan r o yo Kan r o yo
Reacción de Gateway BP Reacción de Gateway BP
L4 R1R L1 L2
Promotor ORF
Promotor Seleccionar en DH5 α ORF

Clon de entrada bacterias. Clon de entrada
Kan r o yo
Kan r o yo
FIGURA 2. Generando un clon de Entry usando una reacción Gateway BP. La creación de clones de entrada, que se muestra aquí, implica
la propagación de un vector donante en bacterias DB3.1, amplificando un producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con
att Sitios B, y luego configurar una reacción Gateway BP. Las enzimas clonasas de BP recombinan el att B y att Sitios P, reemplazando el
casete Gateway con el inserto amplificado, que ahora está flanqueado por att L o att Sitios R dependiendo de la configuración de los
fragmentos de ADN y los vectores. La reacción que se muestra en la izquierda genera un clon de entrada del promotor, mientras que el
que se muestra en el derecho genera un clon de entrada ORF. Tenga en cuenta que la clonación unidireccional está asegurada porque
att Los sitios B1 solo se recombinan con att Sitios P1, att Sitios B2 con att Sitios P2, etc. Después de que la mezcla de reacción de BP se
transforme en una cepa de clonación bacteriana estándar (como DH5 α), solo el clon Entry conferirá crecimiento. Tenga en cuenta que,
por lo general, la superposición asimétrica está orientada a 5 ′ - 3 ′ hacia el inserto, pero att Los sitios también pueden funcionar en la
orientación inversa y luego se les da la designación " R "( p.ej, att B1R y att P1R). Estos revierten att Los sitios son importantes para generar
clones Entry que se pueden usar en reacciones LR multisitio (Fig. 4).
clones). La E. coli La cepa DB3.1 es resistente a los efectos de la ccdB gen y se utiliza para propagar
vectores Gateway en presencia de cloranfenicol.
Utilizando la técnica Gateway, se han generado bibliotecas de clones Entry y se han derivatizado a clones
Destination para su uso en estudios de alto rendimiento. Por ejemplo, los aproximadamente 12.000 ORF de longitud
completa disponibles en el Caenorhabditis elegans OR Feome (Reboul et al. 2003) se han transferido a vectores de dos
híbridos de levadura para determinar una red de proteínas - interacciones de proteínas (Li et al.
2004). Del mismo modo, muchos de los 6000 promotores del C. elegans Los promotores se clonaron aguas arriba de
GFP para el análisis de la expresión génica y para el mapeo de la red reguladora de la transcripción mediante ensayos
de un híbrido de levadura de alto rendimiento (Dupuy et al. 2004; Deplancke et al. 2006; Vermeirssen et al. 2007).
Cualquier construcción de reportero puede adaptarse para aprovechar las colecciones de clones de Gateway Entry (ver
Cuadro 1). Las técnicas experimentales recientes que se hicieron compatibles con Gateway incluyen la interferencia de
ARN (ARNi) (Rual et al. 2004) y los microarrays de unión a proteínas (Grove et al. 2009).
DESVENTAJAS DE LOS SISTEMAS DE CLONACIÓN GATEWAY Y CLONACIÓN ALTERNATIVA
La clonación de puerta de enlace funciona extremadamente ef fi ciente y robustamente, con un investigador capaz de
generar cientos de construcciones en cuestión de días. La principal desventaja del sistema es que una vez que se
realiza la conversión a la clonación Gateway, es bastante difícil cambiar a otro sistema de recombinación o volver a los
métodos de clonación tradicionales (p. Ej., Porque los codones de inicio / parada a menudo se han eliminado y los
vectores Gateway carecen de sitios convenientes de endonucleasa de restricción). Otra limitación es que los vectores
Gateway y las enzimas de recombinación son bastante costosos. Sin embargo, en nuestra experiencia, el costo - bene fi La
relación t se vuelve favorable una vez que el número de construcciones informadoras requeridas alcanza varias
docenas. Las cuestiones restantes son técnicas, diferirán entre los constructos deseados y se refieren en gran medida
a la introducción de la att sitios (el att Los sitios podrían, por ejemplo, cambiar potencialmente la funcionalidad de la
fusión de proteínas resultante o agregar cis- sitios reguladores a un fragmento de promotor). Sin embargo, tenemos
Cite esta introducción como Protocolos de Harb de Cold Spring; doi: 10.1101 / pdb.top094912 3
Amperio r o yo Amperio r o yo
Vector de destino Vector de destino

R4 L1R R1 R2
Casete de puerta de enlace Reportero Fusión Casete de puerta de enlace
X X X X
Promotor ORF
L4 R1R L1 L2
Promotor ORF
Clon de entrada Clon de entrada
Kan r o yo Kan r o yo
Reacción de puerta de enlace LR Reacción de puerta de enlace LR
B4 B1R B1 B2
Promotor Reportero Fusión ORF
Promotor ORF
Clon de destino Clon de destino
Amperio r o yo Amperio r o yo
FIGURA 3. Generación de un clon de destino mediante una reacción de Gateway LR. En una reacción Gateway LR, un clon de
entrada se mezcla con un vector de destino, y las enzimas clonasas de LR recombinan el att Tierra att Sitios R del subtipo
coincidente (es decir, att R4with att L4, att R1 con att L1), intercambiando el casete Gateway con el inserto clonado. La reacción en
izquierda genera una construcción informadora con un promotor clonado cadena arriba de un informador como GFP o luciferasa. La
reacción en derecho genera una construcción informadora con un ORF clonado en marco con un informador amino-terminal tal como
GST o los restos de dos híbridos de levadura (AD o DB).
demostrado anteriormente que el att Es poco probable que los sitios interfieran con las lecturas de los ensayos de uno y dos
híbridos de levadura (Walhout et al. 2000; Deplancke et al. 2004). Para cada ensayo posterior, se deben utilizar los controles
adecuados para determinar si el att los sitios afectan los resultados. Finalmente, los vectores de destino de la puerta de enlace
se pueden reconocer fi Si es necesario, por ejemplo, para generar extremos proteicos libres moviendo la fusión desde el
extremo amino al extremo carboxi-terminal o introduciendo un nuevo codón de inicio / parada de modo que el att los sitios no
están traducidos.
El sistema de clonación Gateway no es la única opción basada en la recombinación para generar
construcciones informadoras. Los sistemas Univector (Liu et al. 1998) y Creator (Siegel et al. 2004) utilizan
ambos Cre recombinasa del bacteriófago P1 (Abremski y Hoess 1984) que cataliza la recombinación en loxP
Amperio r o yo
Vector de destino
R4 R2
Casete de puerta de enlace Fusión Reacción LR de puerta de enlace multisitio
Amperio r o yo
Promotor :: ORF
Clon de destino
L4
ORF Fusión
L2
yo
Promotor
Pr
o B4 B1 B2
o m
RF
ot
Pr
a
r
Cl
om
ad
Ka
Ka on d RF
on
tr
n
O
en
ot trad
r
de
or a
e
en
Cl
R1
r
L1
n
R
o
yo
FIGURA 4. Reacciones multisitio Gateway LR. En una reacción Gateway LR multisitio, dos clones de entrada se mezclan con un solo vector
de destino y, al igual que en la reacción LR que se muestra en la Figura 3, las enzimas clonasas LR recombinan los subtipos
correspondientes att Tierra att Sitios R. Sin embargo, el resultado de este tipo de recombinación es que los insertos de los dos clones de
entrada (por ejemplo, un promotor y un ORF) se fusionan cuando se reemplaza el casete Gateway.
RECUADRO 1. GENERACIÓN DE VECTORES COMPATIBLES CON GATEWAY
Hacer que el vector indicador deseado sea compatible con Gateway implica el uso de endonucleasas de restricción
convencionales y ligación para clonar un casete Gateway flanqueado por att sitios en la posición adecuada dentro de la
columna vertebral del vector y luego transformar y propagar el producto circular en el DB3.1 E. coli presion. Debido a que
este nuevo plásmido funcionará como un vector de destino que recibe un inserto de un clon de entrada, es importante
utilizar att sitios que son compatibles (por ejemplo, si su vector necesita aceptar ORF de clones pDONR 221, entonces debe
tener att R1 - att Sitios R2). Dependiendo del vector, también puede ser importante clonar el
att sitios en un marco particular (es decir, de modo que cada ORF recombinado se exprese en marco con una fusión amino
o carboxi terminal). Fragmentos de ADN de extremos romos que contienen el casete Gateway flanqueado por att R1 y
att Los sitios R2 están disponibles comercialmente en los tres marcos para la ligadura en su vector de interés. Si es diferente att
Se requieren sitios, se pueden amplificar fragmentos similares a partir de vectores existentes usando PCR. Si no hay vectores
disponibles con el requerido att sitios, existentes att los sitios se pueden modificar usando mutagénesis mediada por PCR.
sitios, mientras que In-Fusion (Berrow et al. 2007), MAGIC (Li y Elledge 2005) y SEFC (Zhu et al.
2009) los sistemas utilizan recombinación homóloga in vitro o dentro de E. coli son. Todos estos sistemas de clonación
alternativos se han utilizado para generar grandes bibliotecas de construcciones informadoras. Los sistemas basados
en cre son super fi Algo similar a Gateway, pero la falta de variedad de sitios de recombinación y vectores de destino
limita las opciones experimentales. Las principales ventajas de la recombinación homóloga son (i) que no requiere la
compra de enzimas recombinasas y (ii) que no se utilizan sitios de recombinación que puedan interferir con el
experimento. Sin embargo, un signi fi La principal desventaja de este enfoque es que las reacciones de transferencia no
siempre son precisas y, por lo tanto, la secuencia con fi rmación de fi Se requieren construcciones finales. Otras ventajas
y desventajas de cada sistema de clonación se enumeran en la Tabla 1.
El sitio web de Life Technologies (Invitrogen, http://www.invitrogen.com), la fuente comercial de

todos los reactivos de clonación de Gateway, presenta protocolos completos (y más información general)
para el sistema Gateway. Los siguientes protocolos asociados son los protocolos más comunes utilizados
en la clonación de Gateway. La fi El primer protocolo asociado describe cómo propagar
TABLA 1. Ventajas y desventajas de diferentes métodos de clonación basados en recombinación
Clonación
sistema (s) Método Ventajas Desventajas
Puerta λ- recombinasas basadas en BP y LR Sin ganancia / pérdida de nucleótidos durante la Necesita comprar enzimas
ese uso att sitios transferencia No se requiere digestión Los sitios de recombinación pueden interferir con
Completamente in vitro Recombinación-reversible experimentar
Utiliza clones de entrada Necesidad de hacer compatible el vector deseado
Docenas de vectores de destino disponibles
Posibilidad de transferencias multisitio
Amplia variedad de sitios de recombinación
Univector Cre recombinasa basada en P1 que Sin ganancia / pérdida de nucleótidos durante la Necesita comprar enzimas
Creador usos loxP sitios transferencia No se requiere digestión Los sitios de recombinación pueden interferir con
Completamente in vitro Utiliza clones de entrada experimentar
Recombinación irreversible
Pocos vectores de destino disponibles No es posible
realizar transferencias de múltiples sitios Variedad limitada
de sitios de recombinación Necesidad de hacer compatible
el vector deseado
Infusión, Recombinación homóloga a Sin sitios de recombinación Ganancia / pérdida ocasional de nucleótidos durante
MAGIA, SEFC No es necesaria la compra de enzimas a transferir
Posibilidad de transferencias multisitio Necesidad de generar inserto por PCR o digestión
Se puede utilizar cualquier vector sin conversión antes de la recombinación
No usa clones de entrada B
a In-fusion es un sistema in vitro que requiere la compra de enzimas, mientras que para MAGIC y SEFC la recombinación ocurre dentro de E. coli son.
B Es posible tener una configuración de tipo clon de entrada en el sistema MAGIC.
Cite esta introducción como Protocolos de Harb de Cold Spring; doi: 10.1101 / pdb.top094912 5
Vectores de puerta de enlace que contienen casetes de puerta de enlace funcionales (consulte Protocolo: Propagación
de vectores de puerta de enlace [ Reece-Hoyes y Walhout 2018a]); dos protocolos adicionales implican la manipulación
de estos vectores con enzimas de recombinación Gateway para generar clones de entrada y destino. De estos, un
protocolo describe cómo generar un clon de entrada de ORF mediante la clonación de BP, seguido de la transferencia
LR del ORF a un vector de destino (ver Protocolo: Generación de un clon de entrada y un clon de destino de marco de
lectura abierto (ORF) [ Reece-Hoyes y Walhout 2018b]). La fi El protocolo final describe una reacción de puerta de enlace
multisitio durante la cual un promotor y un ORF se transfieren simultáneamente desde dos clones de entrada
diferentes al mismo vector de destino utilizando enzimas LR (ver Protocolo: Uso de la clonación LR multisitio para
generar un clon de destino [ Reece-Hoyes y Walhout 2018c]). Los tres de estos protocolos hacen uso de speci fi c
vectores y reacciones de transferencia; Sin embargo, estos pasos se pueden aplicar a cualquier vector de puerta de
enlace y reacción de transferencia simplemente sustituyendo los detalles específicos. fi c al vector requerido, como att sitios,
selección de antibióticos y mezcla de enzimas recombinasas.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Este trabajo fue financiado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) DK068429 y GM082971 a
AJMW
REFERENCIAS
Abremski K, Hoess R. 1984. Bacteriophage P1 site-speci fi c recombinación. Los mutantes de la subunidad A de la ADN girasa suprimen la inhibición del crecimiento del
Puri fi catión y propiedades de la proteína Cre recombinasa. J Biol Chem producto letD (ccdB). J Mol Biol 225: 39 - 52.
259: 1509 - 1514. Reboul J, Vaglio P, Tzellas N, Thierry-Mieg N, Moore T, Jackson C, Shin-i T,
Bernard P, Couturier M. 1992. Muerte celular por la proteína CcdB del plásmido F Kohara Y, Thierry-Mieg D, Thierry-Mieg J, et al. 2001. Las etiquetas de secuencia
implica envenenamiento del ADN - complejos de topoisomerasa II. J Mol Biol de marco de lectura abierta (OST) respaldan la existencia de al menos 17.300
226: 735 - 745. genes en C. elegans. Nat Genet 27: 1 - 5.
Berrow NS, Alderton D, Sainsbury S, Nettleship J, Assenberg R, Rahman N, Reboul J, Vaglio P, Rual JF, Lamesch P, Martinez M, Armstrong CM, Li S,
Stuart DI, Owens RJ. 2007. Un método de clonación independiente de la ligación Jacotot L, Bertin N, Janky R, et al. 2003. C. elegans Versión ORFeome
versátil adecuado para aplicaciones de detección de expresión de alto rendimiento. Res 1.1: Veri experimental fi catión de la anotación del genoma y recurso para la
de ácidos nucleicos 35: e45. expresión de proteínas a escala de proteoma. Nat Genet 34: 35 - 41.
Deplancke B, Dupuy D, Vidal M, Walhout AJM. 2004. A Gateway-compat- Reece-Hoyes JS, Walhout AJM. 2018a. Propagación de vectores Gateway. Frío
ible levadura de un sistema hidruro. Res del genoma 14: 2093 - 2101. Protocolos Spring Harb doi: 10.1101 / pdb.prot094920.
Deplancke B, Mukhopadhyay A, Ao W, Elewa AM, Grove CA, Martinez NJ, Reece-Hoyes JS, Walhout AJM. 2018b. Generando un marco de lectura abierto
Sequerra R, Doucette-Stam L, Reece-Hoyes JS, Hope IA, et al. 2006. Un gen (ORF) Clon de entrada y clon de destino. Protocolos de Harb de Cold Spring
centrado C. elegans proteína - Red de interacción de ADN. Célula 125: doi: 10.1101 / pdb.prot094938.
1193 - 1205. Reece-Hoyes JS, Walhout AJM. 2018c. El uso de la clonación LR multisitio para generar
Dupuy D, Li Q, Deplancke B, Boxem M, Hao T, Lamesch P, Sequerra erate un clon de Destino. Protocolos de Harb de Cold Spring doi: 10.1101 / pdb
R, Bosak S, Doucette-Stam L, Hope IA, et al. 2004. A fi primera versión del Caenorhabditis
. prot094946.
elegans promoterome. Res del genoma 14: 2169 - Rual JF, Ceron J, Koreth J, Hao T, Nicot AS, Hirozane-Kishikawa T,
2175. Vandenhaute J, Orkin SH, Hill DE, van den S, et al. 2004. Hacia la mejora Caenorhabditis
Grove CA, de Masi F, Barrasa MI, Newburger DE, Alkema MJ, Bulyk ML, elegans mapeo de fenomas con una biblioteca de ARNi basada en
Walhout AJ. 2009. Una red multiparamétrica revela una amplia divergencia ORFeome. Res del genoma 14: 2162 - 2168.
entre C. elegans Factores de transcripción de bHLH. Célula 138: 314 - 327. Siegel RW, Velappen N, Pavlik P, Chasteen L, Bradbury A. 2004. Recombi-
Hartley JL, Temple GF, Brasch MA. 2000. Clonación de ADN mediante sitio in vitro. clonación nacional mediante sitios lox heterólogos. GenomeRes 14: 1119 - 1129.
especi fi c recombinación. Res del genoma 10: 1788 - 1795. Vermeirssen V, Barrasa MI, Hidalgo C, Babon JAB, Sequerra R, Doucette-
Li MZ, Elledge SJ. 2005. MAGIC, un método genético in vivo para la Stam L, Barabasi AL, Walhout AJM. 2007. Modularidad del factor de
construcción rápida de moléculas de ADN recombinante. Nat Genet 37: transcripción en un gen centrado C. elegans proteína neuronal central - Red de
311 - 319. interacción de ADN. Res del genoma 17: 1061 - 1071.
Li S, Armstrong CM, Bertin N, Ge H, Milstein S, Boxem M, Vidalain PO, Walhout AJM, Temple GF, Brasch MA, Hartley JL, Lorson MA, van den S,
Han J-DJ, Chesneau A, Hao T, et al. 2004. Un mapa de la red interactoma Vidal M. 2000. Clonación recombinacional GATEWAY: Aplicación a la
del metazoo C. elegans. Ciencias 303: 540 - 543. clonación de un gran número de marcos de lectura abiertos u ORFeomes.
Liu Q, Li MZ, Leibham D, Cortez D, Elledge SJ. 1998. El univector Métodos Enzymol 328: 575 - 592.
sistema de fusión de plásmidos, un método para la construcción rápida de ADN ZhuD, Zhong X, TanR, Chen L, HuangG, Li J, SunX, Xu L, Chen J, Ou Y, et
recombinante sin enzimas de restricción. Curr Biol 8: 1300 - 1309. Alabama. 2009. Clonación de alto rendimiento de marcos de lectura abiertos
Miki T, Park JA, Nagao K, Murayama N, Horiuchi T. 1992. Control de completos de hígado humano utilizando recombinación homóloga en Escherichia coli.
segregación del ADN cromosómico por factor sexual F en Escherichia coli. Bioquímica anal 397: 162 - 167.
John S. Reece-Hoyes y Albertha JM Walhout
Protocolos de Harb de Cold Spring; doi: 10.1101 / pdb.top094912
Reciba alertas gratuitas por correo electrónico cuando nuevos artículos citen este artículo -
Alerta por correo electrónico haga clic aquí.
Servicio
Sujeto Explore artículos sobre temas similares de Protocolos de Cold Spring Harbor.
Categorias
Entrega de ADN / Transferencia de genes (278 artículos)
Bibliotecas de expresiones (46 artículos)
Expresión de genes clonados (73 artículos)
Fusión de genes (15 artículos)
Análisis de alto rendimiento, general (144 artículos)
Bibliotecas (130 artículos)
Biología molecular, general (1112 artículos)
Plásmidos (122 artículos)
Uso de genes reporteros (110 artículos)
Vectores (105 artículos)
Suscribirse a Protocolos de Cold Spring Harbor ir:

http://cshprotocols.cshlp.org/subscriptions
© 2018 Prensa de laboratorio de Cold Spring Harbor

Genetica Microbiana

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Genetica Microbiana

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Facultad de Ciencias Naturales y Matemática

Curso: Genética Microbiana

Tema 6 : Clonamiento en bacterias

BSc. PAUL ANTONIO FERNANDEZ CASTRO

- Universidad Nacional Federico Villareal (UNFV), Peru.

En cada caso, clon = conjunto de elementos genéticamente idénticos (entre sí y al

Diversos descubrimientos científicos han sido de crucial importancia para el

a) plásmidos, moléculas circulares de DNA capaces de replicarse dentro de una

Las técnicas de DNA recombinante permiten insertar y expresar, en el genoma

- Genotecas de genomas eucariontes presentan diversos problemas (presencia de

Las Genotecas pueden generarse de diversas formas y en diferentes vectores.

- poseer un origen de replicación (que les da la capacidad para ser replicados de

pBR322 (generado por ingeniería genética)

Propiedades que un Vector Bacteriano debe tener:

1) El aislamiento inicial o síntesis del fragmento de DNA de interés.

La técnica de Clonación depende de un grupo de enzimas de restricción

En caso de la clonación de secuencias para inducir su expresión, cuando se introduce

1. Preparación del DNA

Es necesario incorporar a éste la secuencia definitiva del mRNA, en forma de secuencia de

Una vez obtenido el cDNA, es necesaria la síntesis de la cadena complementaria

Ejemplo: construcción de un plásmido recombinante

2. Construcción del Plásmido o complejo de DNA vector-insertos.

Sin embargo, se sabe que comprende un cambio transiente en la permeabilidad de la

4. Expresión del DNA clonado en un sistema bacteriano.

▪ El Promotor, que es el sitio donde la ARN polimerasa encargada de la Transcripción se

Por su parte, la eficiencia del proceso de expresión dependerá de varios factores:

APLICACIONES DE LA TECNOLOGÍA DEL DNA RECOMBINANTE

INDUSTRIA FARMACÉUTICA Y SALUD

BioNTech BNT162 COVID-19 Vaccine

Puntos más importantes:

- La Clonación de ADN es una técnica de biología molecular que hace

Los pasos de la clonación de ADN

La clonación de ADN se utiliza para muchos propósitos. Como

1.Abrir el plásmido y "pegar" el gen dentro. Este proceso depende

2. Insertar el plásmido en las bacterias. Se usa selección con

3. Cultivar bacterias portadoras de plásmido en gran cantidad y

Un científico construye un plásmido recombinante bacteriano que contiene un gen que

Figura 1. Electroforesis en gel del ADN de

Los cambios en la secuencia del ADN son mutaciones.

¿Todas las mutaciones cambian el genotipo?

¿Todas las mutaciones cambian el fenotipo?

¿Cuáles son algunos fenotipos de bacterias?

El ADN bacteriano (como cualquier ADN) puede ser alterado por

Las mutaciones pueden provocar cambios en las proteínas.

Se pueden transmitir nuevos rasgos a otros

Las bases (nucleótidos) se cambian (base

Las bases se insertan o eliminan

Las secuencias de ADN se mueven alrededor del genoma

• Sustitución de base • Cambio en una base Da

• Sustitución de bases • resultado

La célula tiene un mecanismo para

identificar la síntesis de nuevas

partida mellas ese ADN. Hay

Mutaciones espontáneas Errores en la replicación

Mutaciones inducidas Causado por un mutágeno

Mutágenos: químicos, físicos

Figura 7.9 (a) Desaminación de citosina a uracilo. (b)

Por productos químicos

• ¿Cuáles son algunos ejemplos de mutágenos físicos? (radiación o productos químicos)

hebra opuesta hace

Este tipo de defecto se puede revertir fácilmente mediante un proceso

Cualquier radiación capaz de desplazar electrones de

Algunos ejemplos son los rayos alfa, beta, gamma y X.