Solemne III Biología Molecular

Facultad de Ciencias de la Vida – Universidad Andrés Bello

NOMBRE:

1) Usted ha generado distintas mutantes bacterianas que poseen distintos problemas en

el proceso de traducción del RNA mensajero a proteínas. A continuación se mencionan
los fenotipos de algunas de estas mutantes. Para cada caso mencione que componente
del proceso de traducción en procariontes podría estar mutando (ausente). Explique y
fundamente su respuesta. (15 puntos)

A) Mutante 1. Al analizar los ribosomas se da cuenta de que todos se encuentran

detenidos. El sitio E se encuentra vacío, el sitio P ocupado por tRNA de fMet cargado y el
sitio A se encuentra ocupado con el segundo tRNA cargado con su respectivo aminoácido
bien posicionado.

Si el tRNA del sitio P está cargado con un aminoácido al igual que el tRNA del sitio A y se
encuentra detenido el ribosoma, esto quiere decir que no está ocurriendo la reacción de
transpeptidación (formación del enlace peptídico entre los dos aminoácidos. Esta
reacción ocurre gracias a la subunidad mayor del ribosoma por lo que la mutación
puede estar a este nivel.

B) Mutante 2. Usted analiza los ribosomas y se da cuenta de que todos tienen el tRNA
de fMet en el sitio P y el sitio A se encuentra un tRNA unido a la proteína EF-tu.

El hecho que todos los ribosomas tengan un tRNA unido a EF-tu en el sitio A significa
que EF-tu no ha podido liberarse del ribosoma, proceso que solamente ocurre cuando
se hidroliza GTP. Por lo tanto, cualquier mutación que afecte la capacidad de EF-Tu de
hidrolizar el GTP explicaría dicho fenotipo
B) Mutante 3. Al analizar los ribosomas se da cuenta de que se encuentran detenidos en
los codones de término de sus respectivos mRNA. El sitio P se encuentra ocupado por el
último tRNA de un codon codificante y el sitio A se encuentra ocupado por la proteína
RF1.

Si la proteína RF1 se encuentra en el sitio A, significa que el factor RRF no ha llegado a

liberar el péptido del último tRNA ni a liberar la proteína RF1. Por lo tanto una mutación
en RRF explicaría dicho fenotipo.
NOMBRE:

2) Sobre las librerías genómicas y de expresión: (12 puntos)

A) Defina y discuta las similitudes y diferencias que existen entre ambas librerías.

Una librería genómica incluye el ADN de todo el genoma de una celula u organismo,
mientras que una librería de expresiòn contiene el ADN que proviene de aquellos
genes que se estaban expresando en un determinado tiempo.

Las librerìas genomicas son mas complejas y grandes que las librerias de expresion.

Para la construcción de ambas se utilizan vectores tales como plasmidios, cosmidos,

fagos, BAC y YAC. Pero para una librerìa genomica se necesitan vectores que permitan
clonamiento de regiones grandes mientras que una librería de expresión puede
construirse con vectores de menor tamaño (no BACs ni YACs).

B) ¿En que consiste el análisis de librerías por hibridación? Describa como podría esta
técnica permitirle analizar ambos tipos de genotecas.

El medodo de analisis basado en hibridación permite identificar el gen o la regiòn de

ADN que uno desea dentro de los cientos de clones de una librerìa genómica o de
expresiòn. Para esto se necesita conocer una parte de la secuencia que se busca ya que
se necesita sintetizar in vitro una sonda (producto de PCR u oligonucleotido) el cual es
marcado radioactivamente. Una vez que se ha sintetizado la sonda, se utiliza un papel
filtro para generar una replica de las colonias bacterianas y se utiliza dicho filtro con las
colonias bacterianas embebidas en él para llevar a cabo una serie de procesos de
desnaturalización y fijación para luego realizar la incubaciòn con la sonda marcada.
Esta sonda sólo se unirá mediante complementariedad de bases a aquellas colonias
que posean el ADN buscado y el papel filtro es finalmente expuesto a un film
autoradiografico para la identificaciòn de aquella colonia en cuyo ADN se uniòn la
sonda.
NOMBRE:

3) Usted desea clonar un fragmento de ADN en el sitio de multiple clonamiento (MCS)

del vector pBIOL240 (ver figura). En la imagen se destacan los sitios de corte únicos como
también los sitios de reconocimiento y corte para cada enzima. De acuerdo a esta
información responda lo siguiente: (12 puntos)

A) Nombre 3 estrategias de clonamiento (combinaciones) que permitirían clonar

dicho fragmento de ADN en el vector pBIOL240. Ejemplo: “Cortaría el vector con
la enzima X y el fragmento de ADN con las enzimas Y y Z”.

1. Cortar tanto vector como fragmento con KpnI

2. Cortar con EcoRI y XhoI el fragmento y ligarlo al plasmidio cortado con EcoRI y SalI

3. Cortar con Ecori y KpnI tanto vector como fragmento.

B) Usted realiza el clonamiento descrito en A. De que color serían las colonias de un

clonamiento exitoso si usted plaquea la reacción de transformación en una placa
suplementada con Ampicilina y Xgal (sustrato cromogenico de la proteína
codificada por el gen lacZ)? Fundamente su respuesta.

Las colonias serán blancas, esto debido a que el clonamiento en el MCS

interrumpe el marco de lectura abierto del gen lacZ. En un clonamiento no
exitoso, la proteína LacZ (betagalactosidada) se producirá y romperá el sustrato
cromogénico Xgal resultando en una colonia de color azul
NOMBRE:
4) Usted recibe un plasmido de 6.3 Kb y se le pide construir un mapa de restricción usando
distintas combinaciones de enzimas de restricción. Usted corre un gel de agarosa al 1%
con cada una de estas reacciones y obtiene un perfil de digestión como el de la figura.
Tomando en cuenta esta información dibuje el mapa de restricción del plasmido. (15
puntos)
NOMBRE:

5) El siguiente esquema representa una vía de reparación del DNA a propósito de un

daño especifico en la doble hebra. Basado en el esquema mostrado, indique cual es la
vía de reparación esquematizada (1p). Y para cada número, indique el nombre de la
enzima involucrada (puede indicar también la actividad enzimática). (1P C/U)

El mecanismo de reparación es el denominado, reparación por escisión de nucleótido

1) DNA glicosidasa
2) Sitio AP
3) Endoucleasa
4) Exonucleasa/Helicasa
5) DNA polimerasa
6) DNA ligasa
NOMBRE:

6) En el inicio de la traducción en eucariotas, ¿Cuál considera usted que es el paso

limitante del proceso? Es decir, aquel que condiciona todos los pasos que facilitan el
reconocimiento del codón de inicio. Explique, desde un punto de vista molecular el
porqué de su respuesta. (10p)

En el inicio de la traducción, el paso limitante del proceso, el cual condiciona todos los
otros pasos posteriores, es el reconocimiento del CAP por eIF4E, el cual al unirse al CAP
permite que eIF4A e IF4G puedan, el primero con su actividad helicasa, desarmar
cualquier estructura secundaría del 5’ UTR y permitir la posterior unión de la subunidad
menor del ribosoma conteniendo el tRNAmet y así iniciar posteriormente el scaning del
mRNA en busca del codón de inicio; mientras eIF4G cumplirá su rol de andamio
molecular que conectará el 5’ del mRNA con la cola de poli A al 3’ mediante su unión a
la proteína PABP, asegurando de esa manera el control de calidad de la integridad del
mRNA y asegurando una eficiente traducción. Todos estos pasos se encuentran
condicionados sí o sí al reconocimiento del CAP por parte del eIF4E.

7) Si en una célula, una mutación tipo mistmatch no es reparada, ¿Cuál será el

porcentaje de las células hijas que contengan la mutación después de la tercera
generación de división celular? Explique su respuesta. (Puede usar esquemas) (9p)