Transformacin por choque trmico

La transformacin de clulas competentes, es el proceso gracias al cual podemos introducir nuestro

plsmido en la bacteria. La competencia es un estado fisiolgico especial que presentan algunas bacterias de
forma natural, y que podemos inducir en otras, y que las hace especialmente permeables a la entrada de
plsmidos. Esta permeabilidad se debe a alteraciones que sufre la membrana celular.
Al ser un estado fisiolgico especial, no todas las bacterias lo presentan, pero si podemos conseguir
mediante el proceso de transformacin que ciertas bacterias que no son competentes, adquieran este rasgo de
forma temporal. En mis prcticas, he convertido bacterias, Escherichia Coli, en competentes mediante un
choque trmico en un medio con cationes divalentes, entre ellos el Ca2+.
La combinacin de la temperatura y los cationes, aumenta la porosidad de la membrana celular,
facilitando la asimilacin de los plsmidos. De esta forma atravesarn la membrana celular cualquier
plsmido que se encuentre en su forma circular o superenrollada. Los plsmidos lineales tienen ms
dificultad para penetrar la membrana.
Para la transformacin seguimos el protocolo siguiente:
1) Toma la reaccin de ligacin que tenemos en el hielo (ver el post de Ligacin de un plsmido a un vector de
clonacin) y aade 2 micro litro de sta sobre el vial de clulas competentes. Se debe mezclar, agitando muy
suavemente el vial, nunca pipeteando.
2) Incubamos 5-30 minutos en hielo. La duracin de sta etapa no afecta al rendimiento de la transformacin y
asimilacin.
3) Se procede a realizar el choque trmico de las clulas que provocar la aparicin de poros, con la ayuda del
Ca, en las membranas que dejarn pasar a los plsmidos. Esto es debido a que el Ca se une mediante
interacciones electrostticas con el ADN (cargado negativamente), y a que tiene afinidad por los lpidos de
membrana (tambin con densidad de carga negativa). De sta forma desestabiliza la membrana y acerca el
ADN a sta. Para ello debemos tener un bao de agua a 42 C, durante 30 segundos. No agitar, ni remover el
vial.
Pasado este tiempo se ponen de nuevo en el hielo rpidamente de forma suave. De esta forma se cierran los
poros. En ste paso mueren una gran proporcin de las clulas, por eso se deben coger cuando estn en la fase
logartmica de crecimiento celular.
4) Se aade 250 micro litro de medio S.O.C al vial de clulas. El medio SOC es especial para la
transformacin de las clulas competentes. Es un medio isotnico que cubre las necesidades de las clulas tras
el estrs del choque trmico. Tiene peptona, que aporta nitrgeno y aminocidos; extracto de levadura que
aporta vitaminas, en especial del grupo B; sales minerales sulfato de magnesio (fuente de magnesio, necesario
por ejemplo para la polimerasa), cloruro de sodio y de potasio necesarios para el transporte y el equilibrio

osmtico; y la glucosa que aporta la energa y es una fuente de C, utilizada entre otras cosas para reparar la
perforacin de la membrana celular tras el choque trmico5.
Triptona
20 g/l
Extracto de levadura
5 g/l
Glucosa
3,6 g/l
Cloruro potsico
0,186 g/l
Cloruro sdico
0,5 g/l
Cloruro magnsico
0,96 g/l
Composicin del medio S.O.C.

5)

Crecer durante una hora en el vial a 37 C en agitacin fuerte (200 rpm).

6)

Coge 20-50 micro litro a medios selectivos de cultivo slidos. Se recomienda tomar dos volmenes distintos
para que al menos una de las placas tenga las colonias en la cantidad justa para poder picarlas sin problemas.

7)

Deja crecer las colonias en estufas de cultivo a 37 C. Si el antibitico es ampicilina, basta con dejarlas
crecer 8 horas, para kanamicina es necesario cultivarlo toda la noche (las bacterias con ampicilina, tambin
pueden dejarse toda la noche).
Pasado el tiempo de crecimiento, ya se tienen los clones.

Transformacin por electroporacin

La electroporacin o electropermeabilizacin consiste en provocar un aumento significativo de la
conductividad elctrica y la permeabilidad de la membrana plasmtica celular mediante un campo elctrico
aplicado externamente. Es habitual en biologa molecular como forma de introduccin de diferentes
sustancias en clulas, como por ejemplo sondas moleculares, un frmaco que puede cambiar las funciones
celulares o un fragmento de DNA codificante, como puede ser un plsmido.
Cuando el voltaje que atraviesa una membrana plasmtica excede su rigidez dielctrica se forman poros. Si la
fuerza del campo elctrico aplicado o la duracin de la exposicin al mismo se eligen apropiadamente, los
poros formados por el pulso elctrico se sellan tras un corto perodo, durante el cual los compuestos
extracelulares tienen la oportunidad de entrar a la clula. Sin embargo, una exposicin excesiva de clulas
vivas a campos elctricos puede causar apoptosis o necrosis, procesos que provocan la muerte celular.
En biologa molecular, el proceso de electroporacin se usa frecuentemente para la transformacin de
bacterias, levaduras y protoplastos vegetales. Adems de membranas lipdicas, las bacterias tambin tienen
una pared celular compuesta de peptidoglicano y sus derivados. Sin embargo, las paredes son porosas por
naturaleza y slo actan como corazas que protegen a la clula de impactos ambientales severos.

Si se mezclan bacterias y plsmidos, stos pueden transferirse al interior de las clulas durante la
electroporacin. En este proceso suelen emplearse varios cientos de voltios, que atraviesan una distancia de
varios milmetros. A continuacin, las clulas deben manipularse cuidadosamente hasta que tengan la
oportunidad de dividirse, produciendo nuevas clulas que contendrn copias del plsmido. Este proceso es
aproximadamente diez veces ms eficaz que la transformacin por mtodos qumicos.
Este procedimiento es tambin muy eficiente para la introduccin de genes externos en clulas en cultivo,
especialmente en las de mamfero. Por ejemplo, se usa en el proceso de produccin de ratones knockout, as
como en el tratamiento de tumores, terapia gnica y terapias basadas en clulas.

Proceso
La electroporacin se lleva a cabo en un electroporador, un aparato que crea un campo electromagntico a
travs de la suspensin celular (tpicamente bacterias, aunque se puede aplicar a otros tipos de clulas, como
se ha comentado anteriormente). La suspensin se pipetea en una cubeta de plstico o vidrio con electrodos de
aluminio en los costados.
Por ejemplo, para la electroporacin de bacterias suelen utilizarse unos 50 L de suspensin celular. Antes de
la electroporacin las clulas se mezclan con los plsmidos con los que se quieren transformar. La mezcla se
pipetea en la cubeta, se selecciona el voltaje en el electroporador (unos 240 voltios, por ejemplo) y la cubeta
se inserta en el electroporador. Inmediatamente despus de la electroporacin se aade 1 ml de medio de
cultivo a las bacterias (en la propia cubeta o en un tubo de microcentrfuga) y se incuban a la temperatura
ptima de las bacterias durante una hora o ms para despus extenderlas en una placa con agar.
El xito de la electroporacin depende en gran medida de la pureza de la disolucin de plsmido,
especialmente de su contenido en sales. Las disoluciones impuras pueden causar una pequea explosin (un
arco elctrico), en cuyo caso las clulas moriran. Si esto ocurre a menudo, podra ser necesaria una
sedimentacin de las clulas antes de una nueva electroporacin.