UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO

FACULTAD DE CIENCIA E INGENIERÍA EN

ALIMENTOS Y BIOTECNOLOGÍA
CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA
LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
Nivel Cuarto Semestre Paralelo “A”
Docente Ing. Helena de la Torre
Ciclo académico Octubre 2021-febrero 2022
• Carrera Wendy
• Doicela Lizbeth
Integrantes
• Núñez Carolina
• Viracucha Ketsi

EXTRACCIÓN DE DNA Y PESO MOLECULAR DE DNA

1. OBJETIVOS
a. Objetivo general
• Analizar el fundamento de la extracción de ADN en una muestra de células
humanas mediante un simulador virtual, con la finalidad de conocer como
esta se aplica en el proceso de electroforesis.
b. Objetivos específicos
• Determinar la importancia del uso de todos los reactivos en la extracción de
ADN de una muestra de saliva humana.
• Explicar la relación entre la movilidad de los fragmentos con el peso
molecular del ADN mediante la electroforesis en gel de agarosa.
2. INTRODUCCIÓN:

El ADN es una molécula que contiene la información genética de los seres vivos. La mayor
parte del ADN se encuentra en el núcleo de la célula (ADN nuclear), aunque también existe
una pequeña cantidad en las mitocondrias (ADN mitocondrial) (Pinilla, 2020). Esta molécula
está formada por ácidos nucleicos y posee una estructura de doble hélice que se enrolla en
espiral, la cual transporta la información genética necesaria para que el ser vivo pueda llevar a
cabo varias funciones como crecer, desarrollarse y reproducirse. Además, este ácido nucleico
está compuesto por cuatro bases nitrogenadas: adenina, guanina, citosina y timina; en donde el
orden que adopten estas bases determinará el código genético de cada ser vivo (López, 2011).
 El ADN se usa en diversas investigaciones, por tal motivo es necesario que está molécula
se encuentre aislada y purificada. La extracción del ADN es una de las técnicas para aislar esta
molécula, misma que se realiza en diferentes etapas, como son: lisis celular, eliminación de las
proteínas y contaminantes, concentración o precipitación del ADN y finalmente la hidratación
o re-suspensión. Caben mencionar, que este proceso depende si la célula es animal, vegetal,
eucariota, procariota, etc. (Pinilla, 2020).

La electroforesis es una técnica de separación de ADN que se realiza en función de la carga,

tamaño y nivel de enrollamiento de la molécula de ADN (Austin, 2020). Se fundamenta en el
uso de carga eléctrica para mover las moléculas y de este modo separarlas a través de un gel,
el cual contiene unos poros que actúan como un colador permitiendo que las moléculas más
pequeñas de ADN se muevan a mayor velocidad que las más grandes, sin embargo, la
electroforesis permite modificar ciertas condiciones para separar moléculas con el tamaño que
se desee (Austin, 2020), además en consecuencia de la distribución uniforme de la carga en los
ácidos nucleicos, se puede determinar con exactitud los pesos moleculares del ADN debido a
la movilidad que realizan en el gel (Magdeldin, 2012).

MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Materiales y Reactivos

❖ Extracción de ADN

Materiales

• Micropipetas
• Hisopo bucal
• Tubos de muestreo

Reactivos

• Tampón de re-suspensión
• Etanol
• Alcohol isopropílico
• Solución de lisis
• Solución salina concentrada
Equipo

• Micro-centrifuga
❖ Electroforesis en gel

Materiales

• Micropipeta
• Matraz
• Molde de gel
• Peine de gel

Reactivos

• Agarosa en polvo
• Solución de tinción de ADN (bromuro de etidio)
• Tampón de carga

Equipo

• Caja de electroforesis
• Microondas

3.2. Procedimiento experimental

➢ Método de extracción de ADN

1. Se extrajo células del interior de la boca del sujeto con un hisopo para la prueba.
2. Luego se procedió a cortar el hisopo para introducirla en el tubo Eppenorf y sea posible
cerrarla.
3. Con la ayuda de una micropipeta se añadió una solución de lisis al tubo.
4. Se colocó el tubo en baño maría.
5. Se retiró el hisopo del tubo para añadir la solución de sal concentrado al tubo.
6. Se introdujo el tubo en la centrifugadora tomando en cuenta que para obtener el
equilibrio de la centrifugadora se debe introducir un tubo que este con agua al frente
del tubo de estudio.
7. Después de un tiempo determinado se extrajo el tubo y con una micropipeta se retiró el
líquido que se encuentre en la parte superior para trasladarla a un tubo limpio.
8. Al tubo se le agregó alcohol isopropílico.
 9. Manualmente se invirtió el tubo por varias ocasiones y se lo introdujo en la
centrifugadora.
10. Se retiró el tubo de la centrifugadora para retirar el líquido con una micropipeta, y dejar
secar el ADN. Si se desea se podrá almacenar en un congelador.
➢ Técnica electroforesis en gel

Elaboración del gel

1. Se tomó una cantidad de agarosa y se introdujo en un matraz.

2. Se añadió una cantidad de tampón (solución de agua salada) líquido al matraz y se lo
tapó con una envoltura de plástico.
3. El matraz fue introducido en el microondas hasta que la agarosa derrita el tampón.
4. La mezcla del matraz se puso en un molde, con el fin de observar que la cinta se
encuentre en su lugar para colocar el peine en el gel en un extremo.
5. Se esperó que el gel se enfrié y se solidifique durante 30 min.
6. Se retiró el peine observando que queden pocillos vacíos.

Configuración de la caja de electroforesis

7. Se vertió el tampón en la caja.

8. Se introdujo el gel en el molde de la caja, observando que la cinta de los extremos no
esté sumergida por completo en el tampón.

Introducción de ADN

9. Con la ayuda de una micropipeta y puntas limpias se tomó el tampón de carga y se

añadió a la muestra de ADN.
10. Se utilizó la micropipeta para transferir el ADN del tubo hacia el pozo de gel.
11. Se introdujo la muestra en el 1er pocillo del gel.
12. Se usó la micropipeta con puntas limpias para absorber el ADN y llevarlo al pozo vacío.
13. Se encendió la máquina para ejecutar el gel, tomando en cuenta que los cables estén
conectados correctamente por su color, además observar que no existan burbujas de
aire en los electrodos de la caja.
14. Al terminar el proceso del gel, se retiró el molde y se analizó la longitud de las muestras
de ADN.
15. Se tiño el ADN en el gel utilizando la solución de filtración de ADN.
16. Se arrastró el gel fuera del molde y se colocó la solución de tinción durante 30 min.
 17. Se retiró el gel de tinción y se llevó a la caja de luz UV.
18. Se determinó las longitudes de las hebras de ADN de la muestra.
3. DISCUSIÓN

Para la extracción de ADN, la solución lisis es el primer reactivo que se ocupó, ya que esta
ayuda que el núcleo y la célula se abran, y pueda liberar al ADN (Dong et al., 2013), se puede
utilizar 3 tipos de soluciones: detergentes (extracción de ADN de parásitos, células en cultivo
y tejido), enzimas (extracción de ADN bacteriano total o plasmídico) o agentes
desnaturalizantes (extracción de ADN de diferentes tipos celulares y tejidos), además se puede
utilizar para la eliminación de proteínas (Concepción & Ureña, 2005), la solución lisis
generalmente está compuesta de: SDS al 10%, NaCl 0,1 mM, Tris – HCl 0,5 mM, a un pH = 8
(Dong et al., 2013). Por otro lado, el tampón de re-suspensión se utiliza generalmente para
un almacenamiento a largo plazo del ADN, ya que este impide que exista un daño por
nucleasas, metales pesados, oxidación por libre radicales o exista un pH inadecuado (Griffiths
& Chacon-Cortes, 2014). Para suspender el ADN se usa el etanol y alcohol isopropílico los
cuales reducen la constante dieléctrica del solvente liberando el ADN de las células
permitiendo que se haga visible en la interfase entre la mezcla y el alcohol, la diferencia que
existe entre estos dos alcoholes es que, el isopropílico posee una mayor capacidad de disminuir
la constante dieléctrica por lo que se usa en menor volumen, pero precipita más sales
produciendo un ADN de menor pureza a diferencia del etanol, por lo que es recomendable usar
etanol, esto dependiendo de la muestra y la concentración de ADN (Hauk, 2016), sin embargo,
por las características fisicoquímicas que presenta el ADN no es soluble en alcohol, por lo que
para lograr una mayor pureza de las muestras se usan las soluciones salinas o en algunos casos
compuestos orgánicos como el fenol, disminuyendo la solubilidad y haciendo que el ADN se
separe más fácilmente, ya que por poseer cargas negativas debido a sus grupos fosfatos en la
estructura los iones de la solución salina con iones de sodio con carga positiva estos son atraídos
por la carga negativa del ADN, permitiendo que se neutralice la carga del ADN, dando como
resultado que las moléculas se unan entre sí (López, 2011).

Los reactivos que se utilizaron en la electroforesis de gel son: agarosa, bromuro de etidio y
una solución tampón de carga. La agarosa es un polímero lineal natural, extraído de algas
marinas de los géneros Gellidium y Gracillaria (Concepción & Ureña, 2005), que forma una
matriz de gel por enlace de hidrógeno cuando se calienta en un tampón y se deja enfriar
(Magdeldin, 2012), la agarosa se usa generalmente para separar moléculas de ácidos nucleicos
de gran tamaño por electroforesis, ya que este posee grandes poros y tiene un amplio rango de
separación, sin embargo, su poder de resolución es relativamente bajo, debido a que en el gel
las bandas que se forman suelen ser esparcidas y difusas (Voet & Voet). Por otro lado, el
bromuro de etidio, es un colorante de monómero de fenantridina estructuralmente similar al
yoduro de propidio, se utiliza como una solución de tinción de ADN (Farrell, 2017), ya que
esta sustancia se interpone entre las bases del ADN, sin preferencia de secuencia aparentemente
una vez cada 4-5 pares de bases, y en conjunto con una fuente de luz UV, se llega a visualizar
las bandas de ADN, ya que este provoca que el colorante unido al mismo produzca una mayor
fluorescencia, a diferencia de estar solo en una solución (Concepción & Ureña, 2005), el modo
de unión de este compuesto en el ADN cambia la carga, el peso, la conformación y la
flexibilidad de la molécula (Farrell, 2017). Por último, la solución tampón de carga,
principalmente se encuentra compuesta de azul de bromofenol, posee propiedades sobre el pH,
la fuerza iónica, la movilidad y la composición de la muestra (Zhang et al., 2011), teniendo
como función principal otorgar color y sumar densidad a la muestra, para visualizar de mejor
manera el recorrido que hace en el gel (Yánez Torres, 2007), cabe recalcar que el pH óptimo
de esta solución se encuentra en 7, sin embargo, la mayoría de los procesos de extracción de
ADN se usan amortiguadores de 8-9, además un tampón con una alta fuerza iónica es más
eficiente debido a su conductividad eléctrica (Magdeldin, 2012).

4. CONCLUSIONES
• La extracción de ADN se fundamenta en la purificación y aislamiento de la misma,
teniendo en cuenta las características fisicoquímicas de la molécula, con el fin de poder
analizarla, manipularla y estudiarla mediante varios métodos, uno de ellos es la
electroforesis el cual consiste en separar en fragmentos el ADN mediante la aplicación
de corriente eléctrica para determinar el peso molecular en función del tamaño y
observar cuantos fragmentos diferentes de ADN se encuentran en una muestra.
• Los reactivos para la extracción de ADN son importantes ya que con ellos se obtiene
muestras de ADN de mayor pureza, con la solución lisis el núcleo de la célula libera el
ADN, el tampón de re-suspensión impide que la muestra se dañe por agentes externos,
los alcoholes etanol e isopropanol precipitan la muestra haciéndola más visible y las
soluciones salinas disminuyen la solubilidad del ADN haciendo que se separe.
• La electroforesis en gel de agarosa permite la separación del ADN en función de su
tamaño. Mediante el gel, el cual contiene unos poros, los fragmentos de ADN se
movilizarán al aplicar una corriente eléctrica, en donde, la velocidad de dicho
movimiento dependerá del peso molecular del ADN, es decir, mientras más pequeños
 sean los fragmentos de ADN se movilizarán más rápido y mientras más grandes sean
se movilizarán más lento por los poros del gel.
5. CUESTIONARIO
1. Consulte el método de extracción de ADN con solventes en laboratorio.

La extracción de ADN por Fenol-Cloroformo-Alcohol Isoamílico es un método muy útil

para obtener ADN de sangre periférica, células o tejidos. Consiste en la adición de fenol y
cloroformo dando lugar a 2 fases: una fase acuosa que posee los ácidos nucleicos y una fase
orgánica que contiene las proteínas disueltas en el fenol y los lípidos disueltos en el cloroformo.
Es importante que el genol tenga un pH de 7-8 para la purificación del ADN. Luego, con la
ayuda de isopropanol o etanol absoluto se precipita el ADN de la fase acuosa y se lava con
etanol al 70% con el fin de eliminar sales y contaminantes. Finalmente, el ADN se re-suspende
en un tampón apropiado.

Los pasos de este método son los siguientes:

Paso 1. Se realiza el lisado celular de la muestra, el cual depende del tipo de muestra que se va
a procesar.

Paso 2. Se adiciona un volumen de fenol al volumen de lisado y se agita la mezcla por inversión
del tubo por 20 segundos.

Paso 3. La muestra se centrifuga a 12,000 rpm durante 3 minutos. Después de esto es posible
evidenciar dos fases: la fase acuosa superior y la fase orgánica. En la interfase entre ambas el
posible observar una capa blanquecina que irá disminuyendo de espesor conforme la muestra
se encuentre más limpia de proteínas y contaminantes.

Paso 4. La fase acuosa con el ADN se coloca en un tubo limpio, teniendo precaución de no
tocar la interfase ni la fase orgánica, dado que estas son desechadas. A la fase acuosa se le
añade un volumen idéntico de una solución combinada de fenol y CIA en proporción 1:1.
Luego se agita hasta obtener una mezcla homogénea.

Paso 5. Nuevamente se centrifuga la mezcla a 12,000 rpm durante 3 minutos. Y se vuelven a

obtener las dos fases mencionadas anteriormente, sin embargo, la interfase es menor a la
anterior. Caben mencionar, si la interfase sigue visible, deben repetirse los pasos 4 y 5.
Paso 6. La fase acuosa se transfiere a otro tubo y se mezcla con cloroformo, ya que este
compuesto atrapa los restos de fenol que hayan quedado en la muestra. La fase acuosa y el
cloroformo se mezclan durante 20 segundos.

Paso 7. Se realiza una centrifugación a 12,000 g durante 3 minutos. Se precipita la fase acuosa
en un tubo limpio con 2 volúmenes de isopropanol. Se incuba la mezcla durante 5-10 minuto.

Paso 8. Se realiza centrifuga a 12,000 g durante 10 minutos para que el ADN se precipite y el
isopropanol es desechado.

Paso 9. El precipitado se lava utilizando 500 µl de etanol al 70% y se centrifuga durante 10-15
min. Si se desea se puede realizar un segundo lavado con etanol para maximizar la purificación
de la muestra.

Paso 10. Se elimina el etanol y se deja secar el precipitado de ADN. Por último, el ADN es re-
suspendido en un volumen adecuado de tampón TE o agua destilada.

(Orfao & Moret, 2011)

2. Indique 3 aplicaciones de la extracción de ADN.

La extracción del ADN tiene un sin número de aplicaciones en las que se puede mencionar
se encuentra las bases de datos forenses civiles donde su principal objetivo es identificar a las
personas muertas con la extracción del ADN de personas no identificadas con el de los
familiares observando características humanitarias (Álvarez et al., 2010).
También se puede usar la extracción de ADN en aplicaciones ambientales donde se puede
tener una muestra de excremento y se lo puede usar para identificar el tipo de dieta de un
animal, así identificar al animal y la especie a la que corresponde con este tipo de información
se puede analizar la diversidad de especies que se encuentra en determinado lugar (Huerta,
2020). Al igual que en el campo de la biomedicina, ya que se puede extraer fragmentos de
ADN con información de células cancerígenas y tumores permitiendo así dar un diagnóstico y
tratamiento más asertivo a los pacientes con este tipo de padecimientos (Álvarez et al., 2010).
3. ¿Qué polímeros pueden ser usados para preparar un gel de electroforesis?

Para preparar un gel de electroforesis se pueden utilizar los siguientes polímeros:

Agarosa: polímero lineal de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa que se extrae de las algas. El gel
se obtiene disolviendo polvo de agarosa en una solución tampón caliente, posteriormente se
deja enfriar la solución a 55 °C para luego verter en un soporte, en donde se solidificará, para
luego ser usado en el equipo de electroforesis (The biotechnology education company, 2016).

Poliacrilamida: polímero que se obtiene como resultado de una reacción de polimerización

entre la acrilamida y N, N'-metileno-bis-acrilamida (BIS) usando un catalizador (Cheriyedath,
2019). Para el gel de poliacrilamida es necesario la elaboración de un hidrogel en, el cual se
separan las proteínas, debido a la fricción que ocurre entre las moléculas de proteína con la
estructura del gel. Los componentes necesarios para la elaboración del gel son: la acrilamida,
TEMED, persulfato y bisacrilamida (UAH, 2015).

4. ¿Cuál es la relación existente entre la concentración de agarosa y el tamaño de

fragmentos a separar?

El gel de agarosa es óptimo para la separación y la purificación de los fragmentos de ADN

cuando no se posee una resolución alta. El gel al presentar un nivel bajo de resolución sus
rangos de tamaño que separan fragmentos serán mayor y dependerán de la concentración, dado
que cuando se tiene baja la concentración del gel de agarosa mayor será el tamaño de las
moléculas al separarse (Fierro, 2014).

5. Qué voltaje se necesita para lograr la migración de los fragmentos de ADN durante
una electroforesis de ADN.

El voltaje aplicado, que se define en V/cm, es determinado en base a la distancia entre los
electrodos, no en la longitud del gel (Magdeldin, 2012) (Lee et al., 2012). El voltaje óptimo a
aplicar dependerá del tamaño del fragmento (kb) y los buffers a utilizar como se muestra en la
Tabla 1 (Magdeldin, 2012). Dentro de un rango entre mayor se aplique el voltaje más rápido
migran las muestras, sin embargo, cuando es demasiado elevado puede generar rayas en la
banda (para ADN de 212-15 kb), por otro lado, cuando este el voltaje es muy bajo, la movilidad
del ADN menor de 1 kb se reducirá y provocara un ensanchamiento de la banda, causada por
la difusión y dispersión (Magdeldin, 2012).

Tabla 1

Buffer y voltajes recomendables de acuerdo al tamaño y aplicación del ADN.

Tamaño (kb) Voltaje (V/cm) Buffer

Recuperación Analito
≤1 5 TAE TBE
1 a 12 4 a 10 TAE TAE/TBE
> 12 1a2 TAE TBE
Nota. La siguiente tabla proporciona una referencia rápida para el voltaje óptimo para
electroforesis del ADN y los tipos de buffers que se ejecutan. Tomado de Gel Electrophoresis:
Principles and Basics (p. 49), por Magdeldin S., BoD– Books on Demand.

A medida que aumenta el voltaje aplicado a un gel, los fragmentos más grandes migran
proporcionalmente más rápido que los fragmentos pequeños, por ello, por ello la mejor manera
de resolución de fragmentos mayores de aproximadamente 2 kb, es programar la fuente de
alimentación a un voltaje no más de 5 voltios por cm al gel (Magdeldin, 2012) (Lee et al.,
2012).

6. BIBLIOGRAFÍA

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Dong, B., Yi, J., Dai, L., & Dai, X. (2013). Evaluation of Several DNA Extraction Methods for
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Griffiths, L., & Chacon-Cortes, D. (2014). Methods for extracting genomic DNA from whole
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Hauk, A. (2016). Präzipitation von Nukleinsäuren. Biologie in Unserer Zeit, 46(6), 344–344.
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Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., & Kim, Y. H. (2012). Agarose gel electrophoresis for
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agarose electrophoresis. Gene, 487(1), 72–74. doi:10.1016/j.gene.2011.05.018

7. PORCENTAJE DE PARTICIPACIÓN

Nombre Participación (%)

Carrera Wendy 100
Doicela Lizbeth 100
Núñez Carolina 100
Viracucha Ketsi 100