Guía de práctica: Extracción de ADN

Práctica N°: Extracción de ADN

Profesor: Viviana Ramos Rueda

I. Introducción

Las características fisiológicas y bioquímicas de todo ser vivo están contenidas en sus respectivos
genomas. Los genomas de bacterias, hongos, plantas, animales y algunos virus están compuestos por
moléculas de ácido desoxirribonucléico (comúnmente llamado ADN). El ADN es una estructura química
cuyos elementos fundamentales (nucleótidos) se organizan de manera lineal generando enormes
secuencias de información. La información que define y codifica un carácter determinad o se denomina
gen (Lewin 1995). Los genes se organizan linealmente y se agrupan formando estructuras llamadas
cromosomas, los cuales pueden ser vistos bajo el microscopio durante ciertas etapas del ciclo de vida de
la célula.

Los genes que posee un individuo en su genoma definen su genotipo. La expresión del genotipo es
afectada en gran medida por el medio ambiente, determinando así la apariencia o rendimiento de un
individuo (fenotipo). La genética estudia cómo el genotipo y el fenotipo son transmitidos de padres a
hijos y junto con la biología molecular han desarrollado técnicas de análisis de poblaciones y de
individuos que permiten ubicar, caracterizar y explicar la heredabilidad de genes u otros fragmentos de
ADN (Lewin, 1995; Rocha, 2002).

La manipulación del ADN es uno de los ejemplos más espectaculares del avance de la aplicación de una
serie de herramientas, que anteriormente no se contemplaban en el campo científico y que, en la
actualidad, se usan de manera rutinaria para desarrollar una amplia variedad de estudios genéticos.

Para estudiar el ADN es imprescindible aislarlo e identificarlo. Existen diferentes métodos de aislamiento,
dependiendo del tipo de estudios o investigación que se quiera realizar. Sin embargo, todos comparten
el hecho de que, debido a que la molécula se encuentra al interior de estructuras membranosas y está
asociada con proteínas, se requiere usar sustancias adecuadas para obtener al ADN de la forma más
purificada posible (Bravo et al., 2012).

Actualmente existen varios métodos para la extracción y purificación de los ácidos nucleicos, los cuales
son seleccionados según: El tipo de ácido nucleico a extraer (ADN genómico, ADN plasmídico, ARN total,
ARN mensajero, entre otros).

1. El organismo de donde se extraerá (células animales, plantas, levaduras, bacterias, virus, etc.)
2. El material de extracción (órganos completos, tejidos, cultivos celulares, sangre, muestras
ambientales, etc.)

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3. Los resultados deseados (rendimientos, pureza, tiempo de purificación, etc.)

4. La aplicación posterior (amplificación, clonación, expresión), transcripción reversa, etc.)

Concentración y pureza de las muestras mediante espectrofotometría.

Mediante espectrofotometría se puede determinar la concentración y la pureza de una muestra de

ADN basándose en la capacidad de absorbancia de un compuesto presente en una solución a una
longitud de onda determinada.

La concentración de la muestra de ADN se calcula teniendo en cuenta el valor de absorbancia obtenido

a una longitud de onda de 260 nm. Mientras que la relación de absorbancias A260/280 se utilizan para
evaluar la pureza de las muestras.

La relación A260/280 es muy estable y se considera que un ADN de pureza óptima tiene un valor entre
1.8-2.0. Un ADN de pureza aceptable debe tener al menos una relación A260/280 > 1.6. Un valor
A260/280 < 1.6 indica una posible contaminación por compuestos aromáticos como fenoles y
proteínas. Un radio A260/280 > 2.1 podría deberse a la presencia de ARN en la muestra.

II. Resultados de Aprendizaje

Conocer las diferentes metodologías a utilizar para lograr un proceso biotecnológico (Extracción de
ADN, Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), electroforesis en gel de agarosa).

III. Materiales, equipos y reactivos

MATERIALES REACTIVOS
Tubos Eppendorf 1.5ml Agua destilada estéril
Puntas azules y amarilla Cloroformo-alcohol isoamílico (24:1)
Microcentrífuga Acetato de sodio 3M frío
Micropipeta 100-1000µl Isopropanol frío
Micropipeta 20-200µl Etanol absoluto
Vortex Aguas destiladas estéril.
Baño María
Gradillas para tubos Eppendorf

IV. Procedimiento

1. Recoja con asa curva media caja del cultivo Bacteriano de 18 horas en Agar Tripticasa de soya y
mezcle con 200 l de agua destilada estéril en un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Mezcle en vortex
por 10 segundos.

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2. Lleve el tubo a ebullición por 15 minutos. Centrifugue durante 5 minutos por 13.000 rpm a
temperatura ambiente.
3. Tome el sobrenadante y transfiéralo a un tubo Eppendorf nuevo y adicione 800 l de la
solución de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y mezcle en el vortex ocasionalmente durante
5 minutos.
4. Centrifugue por 10 minutos a 13.000 rpm para separar las fases de la solución. Recupere el
sobrenadante (fase acuosa) y transfiéralo a otro Eppendorf nuevo.
5. Adicione 250 l de acetato de sodio 3M frío mezcle continuamente por inversión durante 30
segundos, luego adicione 250 l de isopropanol frío y vuelva a mezclar continuamente por
inversión por 5 minutos y ocasionalmente en el vortex por 5 segundos, deje reposar por 5
minutos para precipitar el ADN.
6. Centrifugue durante 5 minutos a 13.000 rpm descarte el sobrenadante con pipeta y adicione
250 l de etanol absoluto desprenda el sedimento con vortex y mezcle continuamente por
inversión durante 1 minuto. Repita este paso una vez más.
7. Centrifugue durante 3 minutos a 13.000 rpm, descarte el sobrenadante con pipeta y deje el
tubo abierto al aire hasta que se evapore el etanol al lado del mechero.
8. Adicione 50 l de agua destilada estéril para resuspender el ADN, mezcle varias veces con la
punta de la micropipeta y luego almacene a 4ºC durante toda la noche.
9. Realice una dilución 1/100 con el ADN resuspendido para hacer mediciones de absorbancia a
260, 280 y 320nm con el objetivo de determinar pureza y concentración del ADN extraído.

V. Resultados

Cuantificación del ADN por el método de absorbancia Método:

1. Diluir una alícuota de 10 µL de con 990 µL de agua destilada estéril (dilución 4 1/100). Mezclar el
ADN gentilmente subiendo y bajando con una pipeta. Espere a que las burbujas se aclaren.
2. Utilizar agua destilada estéril en la celda de referencia (en blanco).
3. Medir la absorbancia a 320 nm, 280 nm, 260 y 230 nm.
4. Calcularlos valores de A280 y A260 corregidos sustrayéndola absorbancia a 320 nm (A320) de los
valores de A280 y A260.
5. Concentración de ADN en ng/µL = A260 corregido × 10 (factor de dilución) × 50 (factor de
conversión).
6. Cociente A260/A280: Dividir el A260 corregido por el A280 corregido.

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Ejemplo
Suponemos que el A320 medido = 0.025, A280= 0.175 y A260= 0.295

La concentración de ADN de la muestra sin diluir será:

(A260 – A320) × 100 [factor de dilución] × 50 [factor de conversión]
= (0.295 – 0.025) × 100 × 50
= 0.270 × 100 × 50
= 1350 ng/μl ó 1350 μg/mL

2. El cociente 260/A280 corregido será:

(A260 – A320) ÷ A280 - A320)
= (0.296 – 0.025) ÷ (0.175 – 0.025)
= 0.270 ÷ 0.150 = 1.80

Evaluación de Pureza

Ejemplo:
El cociente 260/A280 corregido
Es 1.8 lo cual indica según la tabla que ADN su pureza es Óptima.

• Realizar los cálculos de la concentración obtenida y analizar la pureza del ADN con los
resultados obtenidos.

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VI. Preguntas orientadoras

1. ¿Qué es ADN?
2. ¿Cuál es la diferencia entre ADN genómico y ADN cromosómico?
3. Explicar para cada uno de los reactivos utilizados en la práctica que función tienen en la extracción
del ADN
4. Investigue otros métodos diferentes de extracción de ADN que se pueden utilizar.

VII. Recursos digitales

Extracción de ADN: https://youtu.be/a8d8ZNSX880

BANCO NACIONAL DE ADN CARLOS III (Universidad de Salamanca),

http://www.bancoadn.org/docs/programa-control-calidad-muestras.pdf

VIII. Bibliografía

1. Bielaszewska M, Mellmann A, Zhang W, Köck R, Fruth A, Bauwens Andreas, Et Al

Characterisation of the Escherichia coli strain associated with an outbreak of haemolytic
uraemic syndrome in Germany, 2011: a microbiological study. Disponible en
www.thelancet.com/infection Published online June 23, 2011 DOI:10.1016/S1473-
3099(11)70165-7

2. Lewin, B. (1995). Genes V. Oxford University Press, New York.

3. Rocha S. P., (2002). Teoría y práctica para la extracción y purificación de ADN de palma de
aceite. PALMA. 23(2); 9-11.

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