FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNICA

Medicina
Veterinaria
Biología
Molecular
Período
2019-2020

Nombres: Dalton Cedeño, John Morales,

Doménica Carrillo
Tema: Extracción de ADN y electroforesis
Fecha:7/10/2019

I. INTRODUCCION:
La granja de Universidad de las Américas, está ubicada en la parroquia de
Nono, esta empezó el 7 de enero del 2012 al momento va a cumplir 7 años en el 2020.
La granja empezó con 40 vacas y el potrero con 67 su estimado de producción son de
27 a 30 litros en leche. Hasta el momento cuenta con gallinas, cuyes, chanchos y
diferentes tipos de cultivos como frutillas, moras, pimientos, rábano, huevos de gallina
entre otros, todo esto con los químicos con sello verde. (UDLA. s.f)
Para la realización de la extracción de sangre en el ganado, se utilizó una
especie de bovino conocida como Boss Taurus, con el fin de detectar una enfermedad
hereditaria conocida como BLAD.
Esta es una enfermedad autosómica recesiva que aumenta al usar toros
portadores por medio de la inseminación artificial y es transmisible a la herencia
(Norouzy, A. et al. 2005). Esta deficiencia en la capacidad de unión de leucocitos
bovinos a los antígenos (Felmer,D. 1999), resulta importante para pequeños y grandes
productores, ya que muchos de los terneros nacidos con la enfermedad mueren a
temprana edad, es importante saber y reconocer los diferentes métodos para la buena
venopunción es estos animales y posteriormente, revisar en el laboratorio.
Para la extracción de un ADN bovino se va a utilizar el método de kit
comercial. Se ha demostrado que la sensibilidad de detección de la PCR es diferente
1
para diferentes kits de ADN (Dhaliwal, A. 2013), el buen conocimiento de estos kits
ayudaría a ahorrar tiempo y dinero. El fin de los métodos de extracción es conseguir la
purificación del ADN y conseguir eliminar toda clase de impurezas como minerales. Se
va a realizar diferentes procesos para conseguir esta pureza. La lisis es uno de estos
pasos para la extracción del ADN que no es más que la rotura de la membrana celular
puede suceder por una infección de un virus, pero nosotros utilizaremos diferentes
compuestos químicos para esta rotura. Un paso importante para la separación de los
materiales externos que no nos servirán, es la electroforesis.
La electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida con este método
podemos separar los fragmentos de ADN y ARN cuando son sometidas a un campo
eléctrico y verlos en una sencilla tinción (Fierro, F. s.f). Para esto se va a color el
Ladder a cada lado de la cámara y luego se introduce el adn, se espera unas horas
para que el ADN hay recorrido y se visualiza el gel.

II. OBJETIVOS:

• Extraer ADN a partir de células animales usando el método de kit comercial

• Entender los procesos que permiten destruir la mayoría de los componentes
celulares y conservar solamente el ADN
SEGUNDO OBJETIVO DE LA PRACTICA
• Conocer el proceso de elaboración de un gel de agarosa y las variables de las
cuales depende la magnitud de los reactivos usados.
• Entender como es el mecanismo de migración de ácidos nucleicos en geles
porosos.
• Visualizar el material genético extraído e interpretar los resultados.
III. MATERIALES Y METODOS:

Aparatos, equipos e instrumentos Cantidad

VORTEX 3

2
TERMOBLOQUE 1

REFRIGERADORA 1

MINICENTRIFUGA 1

CENTRIFUGA 1

BAÑO MARIA 1

ETANOL ABSOLUTO 99.9% 1

3
MICROPIPETA 0.5-10 ul 1

MICROPIPETA 20-200ul 1

MICROPIPETA 100-1000ul 1

TUBERA EPPENDORFF 1

GUANTES 1

PUNTAS PARA MICROPIPETAS 1

BALANZA DIGITAL 1

MICROONDAS 1

VORTEX 1

FOTODOCUMENTADOR 1

FUENTE DE PODER DE ELECTROFORESIS 1

CAMARA DE ELECTROFORESIS 1

AGAROSA 1

VACUTAINER 19

AGUJA TIPO 18 19

SYBR SAFE DNA 1

Trackit 50 bp DNA ladder 1

10X Blue Juice 1

SESION 1: Se realizo una visita a la granja de Nono que se encuentra a 22km de la
ciudad de Quito. Nos pusimos nuestra vestimenta de trabajo para poder realizar la
venopunción a los bovinos de la granja. Para la correcta extracción de sangre, se procede
a realización de un buen brocado y una tricotomía que es la limpieza de la zona y el corte
del pelaje. Limpiamos la zona con algún compuesto jabonoso para la eliminación de
bacterias. Tenemos dos diferentes zonas para la extracción son la yugular y las coxígeas,
se recomienda utilizar entre la mitad de la segunda o la tercera ya que por ahí por ahí
pasan las venas y arterias caudales que se meten en la zona media. Alzamos la cola de la
vaca y realizamos un ligero pinchazo en esta zona y extraemos la sangre para meterlas
en el tubo.

SESION 2: Se procedió a meter las muestras de sangre de las vacas en la refrigeradora

para preservarlas. En el laboratorio con la muestra madre se hace una lisis. Se recoge
200ul de sangre y se la coloca en un nuevo tubo Eppendorf después se le añade 20ul de
proteinasa K y también 20ul de RNAasa, esperamos unos minutos y se realiza una
mezcla manual.
La muestra ya echo nuestro vortex manual se añade al lisado 200uñ de purelink y se la
mantiene en el vortex. Se incuba por unos 10 minutos en el termobloque para la digestión
proteica.
Para el Binding del DNA se va a añadir etanol 99%, se devuelve al vortex para
homogenizar. La muestra se la coloca en una columna y se centrifuga al 10 0000xg/1 min.
Se descarga el líquido al tacho colector. El ADN ahora estará adherido a la malla de la
mitad del filtro. Para la purificación del ADN, colocamos 500ul de Wash Buffer1 y
centrifugamos y con el Wash Buffer2 se la deja 3 minutos para secar la membrana. Para
la finalización de esta esta sesión se coloca la columna en un nuevo tubo y se coloca el
Elution Buffer en la membrana de la columna, se la incuba temperatura ambiente y
centrifugamos. El último
paso de es guardar nuestro ADN a -20 grados.

SESION 3: Vamos a la balanza para pesar y medir nuestra muestra. Se procede armar la
cámara de electroforesis donde va ir nuestro ADN. La cámara de electroforesis debe ir
con 0,5ul de Syber Safe en la mezcla, la mezcla anterior se la introduce en la cámara y se
deja enfriar y por último en la cámara se introduce los pocillos.
Cuando el gel de agarosa se haya solidificado, se pone el molde dentro de la cámara de
electroforesis que va a estar llena de TBE con la misma concentración. Se mezcla cada
muestra con blue juice para observar la tinción y se pone cata gota de muestra en un
pocillo individual. La cámara de electroforesis se conecta a su fuente de poder.

SESION 4: Teniendo las fotografías de nuestro ADN, se visualiza la tinción y el ADN

concentrado en nuestro pocillo.

IV. RESULTADOS
Sesión 1:
Se obtuvo las muestras de sangre en los tubos adecuados, para en lo posterior observar
varios procesos al cual fue sometida la muestra, a través de la lisis logramos romper
estructuras y componentes celulares y hubo cambios de coloración verde purificación y
negro desnaturalización que confinen el citoplasma y así liberar el contenido logrando una
extracción correcta de ADN.
Sesión 2:
Se logró con las muestras extraídas de ADN con ayuda del gel de agarosa y la cámara de
electroforesis logramos observar el desplazamiento del ADN cuando fue sometido a un
campo eléctrico. De esta manera nuestra muestra que se llama Luisa que se encontraba
en el pocillo uno si logro amplificar y tiene una banda entre 2000 pares de bases.

V. DISCUSION
Se logró obtener el método sin ningún problema ya que respetamos y cumplimos
los procesos de manera adecuada y las normas de bioseguridad para no contaminar
las muestras, también obtuvimos una gran cantidad de sangre de la cual se logró
obtener el ADN, logramos un buen sembrío en el agar. El tiempo que estuvo nuestras
muestras en la cámara de electroforesis fue muy corto de 20 minutos por lo que no se
logró ver una gran migración de nuestro ADN, lo que no era el resultado que se
esperaba, pero sí estuvo bastante aceptable.

VI. CONCLUSIONES
Sesión 1:
• Se logró la extracción de ADN animal de un bovino con la ayuda de un kit
comercial
 • Se logró entender el proceso de lisis que destruye las estructuras y los
componentes celulares a través de cambios de coloración, permitiéndonos
observar solo el ADN.
Sesión 2:
• Se logró conocer el proceso para la elaboración del gel de agarosa
conjuntamente con las magnitudes de los reactivos usados.
• Se comprendió que el mecanismo de migración se da cuando a la muestra le
sometemos a un campo eléctrico con ayuda de un gel de agarosa.
•Se comprendió el funcionamiento de la cámara de electroforesis y el foto documentador
para arrojarnos un resultado de los datos que corresponden a la práctica indicándonos el
número del pocillo y el tamaño de las bandas de nuestro ADN, también aprendimos a
interpretar resultados de los foto documentadores.

VII. ANEXOS

Ilustración 1. Vacas elegidas para la extracción de ADN

Ilustración 2. Venopunción en las últimas vertebras

Ilustración 3. Venopunción en la zona yugular.

Ilustración 4.Tubos madre con sangre de Luisa

Ilustración 5. Spin Columna vacío.

Ilustración 6.Spin Columna con el ADN filtrado.

Ilustración 7.TBE1X, Cámara de electroforesis, pocillos.

Ilustración 8. Cámara de electroforesis con ADN.

Ilustración 9.ADN con tinción

Ilustración 10.ADN colocado en la cámara de electroforesis.

Ilustración 11. ADN finalizado

CUESTIONARIO:

1. Explique la importancia de los siguientes reactivos para la extracción de

DNA: PBS, Proteinasa K, RNasa (insumo de Kit), Pure Link Genomic Lysis
Binding Buffer, etanol a 96%-100% para ligar el DNA, Wash Buffer
1(insumo de Kit), y Wash Buffer 2 (insumo de Kit).

• PBS: Diluye sustancias para el cultivo, es neutro ya que no codifica el perfil

de expresión y el funcionamiento normal. (SOPs, 2008)

• Proteinasa K: inactiva lo que son las RNasas y DNasas, se utiliza para la

 separación de ácidos nucleicos de gran peso. (SENNA, 2018)

• RNasa (insumo de Kit): cataliza la hidrólisis de ARN en grupos pequeños,

es el que aísla el ADN libre de ARN. (RUGELES, 2006)

• Pure Link Genomic Lysis Binding Buffer: Tiene como función disrupción
de la membrana celular y creación de condiciones de para la unión de ADN
en la superficie de la membrana de la columna de hilado de slice. (Babenka,
A. 2018)

• Etanol a 96%-100% para ligar el DNA: Es soluble y el ADN debe estar con
mayor concentración para que se precipite y las sales permanecen asi este
con baja temperatura. (Bustamente, 2017)

• Wash Buffer 1(insumo de Kit): Se utiliza para eliminar residuos de proteínas

y residuos de ARN degradados en la membrana y el tampón de lavado se
utiliza para eliminar residuos de sal en la membrana. (Genaid. s.f)

• Wash Buffer 2 (insumo de Kit): Sirve para romper la fuerza iónica

2. Investigue que es PureLink Genomic DNA Mini Kit

Está diseñado para aislar eficazmente el ADN genómico de células y tejidos de

mamíferos, cola de ratón / rata, muestras de sangre, hisopos bucales, bacterias,
levaduras. Permite que se realicen las extracciones de ADN genómico, sirve para purificar
el ADN. (Thermofisher, 2011)

3. ¿Cuáles son las ventajas de extraer ADN con un Kit comercial que realizar la
extracción de manera manual en el laboratorio?

Las ventajas de un kit comercial es la eficacia que un kit comercial de puede traer de igual
manera el ahorro de tiempo que esta puede traer a la muestra.

4. ¿Cuáles son los métodos para almacenar muestras de sangre una vez extraídas
en el campo para luego procesarlas en laboratorio?

Estos van a depender mucho a la temperatura, sus necesidades de conservación y

limitaciones del tiempo.
4.1. Temperatura ambiente: Este tipo de método asegura la disponibilidad inmediata
4.2. Refrigeración: Esta es para corto plazo y deben estar centrifugados
4.3. Congelación: Es la más usada, y también es usada para muestras que no reaccionan
bien a grandes temperaturas
4.4. Ultra congelación: Esta es usada para muestras a largo plazo, ya que previene que el
adn se degrade.
4.5. Criogenización: Aquí se suspende la actividad biológica. (Abyntek, 2019)

5. ¿Cuáles son los mecanismos de predigestión para extraer ADN presentes en

tejidos duros como huesos y plumas de aves?

En los huesos se pasa por un proceso de descalcificación, se requiere usar de igual

manera reactivos de extracción como proteinasa. En el ave se requiere usar etanol.

6. Investigue los estudios genéticos que se pueden realizar con la extracción de

ADN.

Pruebas citogenéticas: Se puede estudiar anomalías estructurares en los cromosomas.

Pruebas bioquímicas: Se miden aquí a nivel enzimático, estas son anomalías congénitas
del metabolismo.

Pruebas moleculares: Se analiza directamente el ADN. Aquí se usan reactivos químicos

como el PCR para la amplificación de la cadena de DNA.

La hibridación genómica comparativa: Método citogenético molecular, aquí se detectan

pequeñas eliminaciones o duplicaciones.

CUESTIONARIO 2

1. ¿Qué es el Ladder y cuál es su función?

Es un marcador de peso molecular, determina la exactitud de peso del ADN. ( PB-L, 2017)
2. ¿Cuál es la función del TBE?
Es un tampón encargado de separar los ácidos nucleicos (Gomes, 2011)

3. ¿Qué es el Syber Safe y cuál es su función?

Es un colorante de camina actúa como bromuro de etilio pero es menos tóxico, dice como
mancha para poder visualizar el ADN (ThermoFisher, 2017)
4. Cuál es la diferencia entre electroforesis en gel de agarosa y en
poliacrilamida.
Agarosa: facilita su manipulación ya que con poca concentración logra separar grandes
muestras

Poliacrilamida: separa muestras muy pequeñas teniendo el riesgo de que el gel se vea
afectado ya que utiliza acrilamida que es un neurotóxico (Cárdenas, 2012)

5. Cuál es la función de: Blue juice, Orange G, Azul de bromo fenol y el Nitrato
de plata, bromuro de etidio.
Blue juice: se encarga de rastrear muestras de ADN en muestras de agarosa y
poliacrilamida, no opaca los tienen ya que se lleva a cabo fuera de los límites.
(ThermoFisher, 2017)

Orange G: es un tinte ácido que ayuda a encontrar presencia de cáncer escamoso gracias
a una mancha color naranja fuerte y brillante (Keebler, 2008)

Azul de bromo fenol: es utilizado para asegurarnos del proceso de electroforesis, es

principalmente un indicador de pH. (SOPs)

6. ¿Cuáles son los problemas que podrían presentarse para que no se pueda
realizar una electroforesis de manera adecuada?

• No saber manejar las pipetas: esto es un problema ya que al no poder absorber

bien podríamos perder parte de nuestra muestra.
 • La falta de algún reactivo: esto afecta ya que para tener los resultados correctos
hay que seguir la guía con los reactivos establecidos y el orden que se pide.

• Malas medidas y no respetar tiempos: los resultados se pueden ver alterados si

cogemos más o menos de las medidas establecidas y si no dejamos reposar el
tiempo que se necesita para que cada reactivo actúe de manera correcta

VIII. BIBLIOGRAFIA

Abyntek (2019). A qué temperatura almacenar muestras biológicas. [online] Abyntek

Biopharma. Available at: http://www.abyntek.com/almacenar-muestras-biologicas/
[Accessed 29 Nov. 2019].

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Nov. 2019].

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Felmer D., Ricardo, Butendieck B., Norberto, Butendieck B., Bárbara, & Villegas M.,
Juana. (2001). DETECCIÓN DE UN DEFECTO GENÉTICO EN BOVINOS
MEDIANTE UNA PRUEBA DE ADN.. Agricultura Técnica, 61(1), 42-
50. https://dx.doi.org/10.4067/S0365-28072001000100005

Fierro, F. (2019). Electroforesis de ADN. [online] Micrositios.inecc.gob.mx. Available at:

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