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Universidad Autónoma de Bucaramanga

Facultad de Ciencias de la Salud

Biología Celular y Molecular

Laboratorio Extracción de ADN

Equipo Docente Primer Semestre – Medicina

COMPETENCIAS

1. Aplica los principios del proceso de extracción del ADN.

2. Comprende la importancia de aislar el ADN de los organismos.
3. Aplica los conceptos de la estructura de los ácidos nucleicos para emitir conclusiones acerca
de su concentración y estructura química presente en soluciones.

INTRODUCCIÓN

Las características fisiológicas y bioquímicas de todo ser vivo están contenidas en sus respectivos
genomas, compuestos por moléculas de ácido desoxirribonucleico, ADN. La extracción de ADN se
realiza para aislar esta molécula con un alto grado de pureza y poderla utilizar en diferentes áreas
como investigación científica, medicina, ciencias forenses, ingeniería genética, entre otras.

Actualmente, existen diferentes métodos para lograr el aislamiento de la molécula de ADN a partir
de tres pasos principales: extracción, purificación y precipitación.

1. Extracción: en esta etapa se separa el ADN de otros componentes celulares empleando

diferentes sustancias químicas como detergentes (SDS/Triton-X) y sales.
2. Purificación: en esta fase el ADN se separa de cualquier contaminante como debris
(residuos) celulares, proteínas y ARN. Los científicos usualmente usan una solución de
(fenol: cloroformo: alcohol isoamílico)
3. Precipitación: el ADN es precipitado para formar fibras delgadas blancas o transparentes.
Para ello, se adiciona etanol.

Una vez se aísla el ADN, su concentración puede cuantificarse mediante diferentes técnicas. El
método más común es por espectrofotometría, en donde se va a medir la absorbancia de la
solución que contiene el ADN disuelto a una longitud de onda de 260 nm (luz ultravioleta, UV). El
ADN tiene su máxima capacidad de absorber luz a esta longitud de onda (figura 1), lo que permite
su detección y cuantificación.
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Figura 1. Espectro de absorbancia de

una solución pura de ADN. El pico
máximo de absorbancia se observa a 260
nm.
Tomado de (1)

Sin embargo, esta capacidad de

absorber luz UV se ve afectada por la estructura del ADN, generando el efecto hipercrómico (el ADN
desnaturalizado tiene mayor capacidad de absorber luz UV). Por tanto, al hacer mediciones se debe
tener precaución con las conclusiones que se formulen.

Otra forma de medir la concentración de ADN en una solución es mediante sustancias que se
intercalan en la estructura de doble hélice de esta molécula. Este método de detección es considerado
una forma indirecta para verificar la presencia de ADN en una solución y la estructura en la que está
presente. En este caso, la detección se basa en que el agente intercalante (como el azul de metileno,
el bromuro de etidio, el sybergreen, entre otros) se une a la doble hélice del ADN, y se mide la
absorbancia de la solución empleando la longitud de onda a la que este agente puede absorber luz.
La figura 2 muestra la interacción del agente intercalante con la doble hélice del ADN.

Figura 2. Interacción de un agente intercalante con la

estructura de doble hélice de ADN.
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PREGUNTAS A DESARROLLAR ANTES DEL LABORATORIO:

1. Leer y analizar completamente la guía antes de llegar al laboratorio. Para esto, realizar un
mapa conceptual donde se esquematice el procedimiento a seguir durante la práctica de
laboratorio (ver más adelante). Este mapa debe realizarse de manera individual y es un
requisito para desarrollar la práctica de laboratorio.
2. Una vez se extrae el ADN, ¿para qué se podría usar?
3. Al final del procedimiento, ¿cómo espera observar el ADN? ¿Espera ver la doble hélice?
4. ¿Dónde se encuentra el ADN?
5. En el proceso de extracción de ADN se emplea detergente, sal y etanol. ¿Cuál es la función
de cada una de estas sustancias? ¿Cómo actúan estas sustancias?
6. ¿Cómo podría cuantificar el ADN que aislará durante la práctica de laboratorio?

MATERIALES

*** Material que debe traer cada pareja o grupo de laboratorio.

- 15 g de fresa: ***cada grupo debe traer solamente 3 fresas, en buen estado

- Sal de mesa (cloruro de sodio)
- Tubos Falcón de 15 mL (3 tubos por grupo)
- Centrífuga
- Espectrofotómetro
- Cuchara desechable: ***traer dos cucharas por grupo que sean largas
- Agua destilada
- Tubos eppendorf
- Etanol frío (100% y 80%)
- Detergente líquido
- Bolsa ziploc mediana: ***traer una bolsa ziploc por grupo
- Puntas de 1.000 μL
- Puntas de 200 μL
- Micropipetas
- Vaso de precipitados de 100 mL o 250 mL
- Espátulas

PROCEDIMIENTO

Nota: Los tres primeros pasos, NO necesitan hacerlos. Estas soluciones y condiciones las
encontrarán listas para usar el día de la práctica.

Al principio de la práctica, se asignará a cada grupo las condiciones que va a emplear para realizar la
extracción de ADN. Por favor, apuntarlas y usarlas durante el desarrollo de la práctica.

1. Preparar la solución de lisis: 10% p/v detergente líquido + 4,5% cloruro de sodio en agua destilada.
Por cada 100 mL de solución, mezclar 4,5 g de cloruro de sodio, 10 mL de detergente líquido y 86
mL de agua destilada.

Dejar reposar la solución de lisis a temperatura ambiente hasta su uso. Hacer alícuotas de 15 mL de
la solución de lisis en los tubos Falcón (el número de alícuotas depende del total de grupos de cada
sección).
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2. El día anterior a la práctica, preparar una solución de etanol al 100% y otra al 80%, y hacer
alícuotas de 6 mL de cada una de ellas en tubos Falcón de 15 mL. Cada grupo usará una de estas
alícuotas el día de la práctica. Almacenar estas soluciones a -20°C desde la noche anterior a la práctica
de laboratorio.

3. Calentar el baño maría a 60 °C.

4. Cortar la fresa en pedazos pequeños, y pesar 15 g.

5. Cortar la fresa que se pesó en el paso 3 en fragmentos más pequeños, y agregarlos a la bolsa
ziploc mediana.

6. Cerrar la bolsa completamente, y macerar la fruta con sus dedos durante dos minutos. Se debe
ser muy cuidadoso con el fin de no romper la bolsa.

7. Abrir la bolsa, y agregar los 15 mL de la solución de lisis. Antes de agregar esta solución, por favor
mezclarla para obtener un liquido homogéneo. Para esto, invertir el tubo hacia arriba y hacia abajo
varias veces (asegúrese que está bien cerrado).

8. Cerrar la bolsa completamente, y presionar la fruta con la solución suavemente durante 1 minuto.

9. Esperar 5 minutos. Después de este tiempo, transferir la solución a un vaso de precipitados.

10. Transferir 13 mL de esta solución (fruta + solución de lisis) al tubo Falcón donde estaba la
solución de lisis. Tratar de agregar la máxima cantidad de líquido posible sin remanentes de fruta.
Marcar el tubo con sus iniciales.

11. Según las condiciones asignadas al principio de la práctica, seguir la parte a o b de este paso.

a. Si debe calentar la solución, poner el tubo del paso 10 en el baño maría por 15 minutos.
Asegúrese que el baño maría se encuentre a 60 °C. Agitar la solución ocasionalmente con el
fin de distribuir el calor.

b. Si no debe calentar, siga al paso 13.

12. Permitir que la solución se enfríe por 5 minutos.

13. Centrifugar por 10 minutos a 10.000 rpm. En este paso, TODOS los grupos que tengan la misma
condición de calentamiento (con o sin calentamiento) deben centrifugar los tubos al mismo tiempo.

14. Remover el tubo de la centrifuga, y transferir cuidadosamente 3 mL del sobrenadante a un tubo

nuevo de 15 mL. Para esto, usar una micropipeta de 1000 µl. Marcar el tubo con sus iniciales.

15. Poner los tubos en la nevera por 5 minutos.

Precipitación del ADN

16. Agregar lentamente 6 mL de etanol al 100% u 80% (según la condición asignada al principio de
la práctica). Para esto, dejar escurrir por las paredes del tubo la solución de etanol fría.

17. El etanol formará una capa sobre la superficie de la solución, creando una interfase. Permitir que
la solución repose 2 minutos, sin moverla. Anotar las observaciones de lo que ocurre.

18. El ADN precipitará en la interfase con el alcohol. Este ADN lucirá como fibras o un líquido viscoso
transparente o blanco.
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19. Tomar el ADN usando el palo de la cuchara de plástico, y transferirlo a un tubo nuevo de 15 mL.
Marcar el tubo con sus iniciales.

20. Centrifugar por 5 minutos a 10.000 rpm. En este paso, TODOS los grupos con la misma condición
de calentamiento (con o sin calentamiento) deben centrifugar los tubos al mismo tiempo.

21. Con una micropipeta de 1000 µl, remover cuidadosamente el sobrenadante, tanto como sea
posible, sin perturbar el ADN, el cual quedará en el fondo y en la pared del tubo.

22. Agregar 3 mL de agua destilada, y mezclar hasta que el ADN se disuelva completamente. Para
esto, uso el vórtex Esta solución se llamará solución de ADN pura.

Detección indirecta de la concentración de ADN

23. Preparar las siguientes diluciones en tubos eppendorf. Marcar cada tubo con su respectiva
etiqueta previamente.

a. Tubo 1: agregar 1 mL de la solución de ADN pura

b. Tubo 2 (dilución 1:2): agregar 500 µL de solución de ADN pura y 500 µL de agua destilada
c. Tubo 3 (dilución 1:4): agregar 250 µL de solución de ADN pura y 750 µL de agua destilada
d. Tubo 4 (dilución 1:8): agregar 125 µL de solución de ADN pura y 875 µL de agua destilada

24. Agitar cada tubo con el fin de mezclar uniformemente.

25. Medir la absorbancia de cada una de las diluciones obtenidas en el paso 24 empleando un
espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm. No olvidar establecer el blanco en el equipo
de medición. Para esto, seguir los siguientes pasos:
a. Preparar 1 mL del blanco adecuado en un tubo eppendorf. Marcar el tubo como blanco.
b. Transferir el blanco a una cubeta para medición.
c. Establecer el blanco en el equipo de medición.
d. Transferir cada una de las diluciones obtenidas en el paso 24 en una cubeta de
medición independiente (una cubeta por tubo), y medir la absorbancia.

26. Registrar los valores obtenidos de absorbancia para cada una de las disoluciones medidas en la
hoja de resultados entregada al principio de la práctica.

27. Con sus compañeros del mismo mesón, responder las preguntas de la parte de discusión
entregadas al principio de la práctica.

BIBLIOGRAFÍA

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2. Oliva, Rafael. Genética médica. 2004.
3. Passarge, Eberhard. Genética. 2004
4. Benito Jiménez, Cesar. Genética. 2012
5. Reissig, José Luis. La genética y la revolución en las ciencias biológicas.
6. Salavarrieta, P. J. R. Teoría y práctica para la extracción y purificación del ADN de palma de
aceite. 2002.
https://www.researchgate.net/profile/Pedro_Rocha2/publication/236516615_Teoria_y_practica_para_la_extraccion_y_purific
acion_del_ADN_en_palma_de_aceite_Theory_and_practice_for_the_extraction_and_purification_of_the_oil_palm_DNA/links/
0deec518a6feb0349c000000.pdf