1.

Explicar la obtención de un homogeneizado de hígado de rata mediante

el método de Scheneider y col.
Preparación del homogenizado en hígado
Para la preparación de las mitocondrias, se usó el método descrito por el
método de Schneider modificado, Oyola, 1957. Extraído el hígado de las ratas,
se coloca inmediatamente en solución de sacarosa 0.25 M a 0°C. Se pesa el
total del hígado, se le añade 5 veces su peso de sacarosa helada 0.25 M.
Se tritura y luego se coloca en los homogeneizadores de Potter Evehjem,
procediéndose al homogenizado el cual es sumergido en un baño de hielo
durante el procedimiento, evitándose velocidades excesivas para no fraccionar
las mitocondrias.
Aislamiento
Obtención de fracción nuclear cruda (FNC)
El homogenizado se distribuye en tubos de celulosa, fueron centrifugados a
600 x g durante 10 min., a 4° C. El sedimento obtenido corresponde a la
fracción nuclear cruda, fue lavado 2 veces mediante resuspensión en tampón A
y centrifugado nuevamente a 600 x g por 10 min. El sobrenadante se utilizará
para la obtención de la fracción mitocondrial.
Obtención de fracción mitocondrial (FM)
El sobrenadante que se obtuvo anteriormente, fue centrifugado a 15.000 x g
durante 10 minutos a 4ºC en una centrífuga refrigerada. El sedimento obtenido,
correspondiente a la fracción mitocondrial, fue lavado 2 veces mediante
resuspensión en tampón A y centrifugado a 15.000 x g durante 10 minutos a
4ºC. El sobrenadante fue utilizado para obtener la fracción microsomal.
Obtención de fracciones microsomal (Fm) y Sobrenadante (S)
El sobrenadante que se obtuvo con anterioridad, fue centrifugado a 100.000 x g
durante 60 minutos a 4ºC en ultracentrífuga. El sedimento obtenido
corresponde a la fracción microsomal. El sobrenadante corresponde a la
fracción sobrenadante.
Se procede a determinar el contenido.
2. Objetivar o determinar la distribución intracelular de las enzimas de
óxido-reducción.
3. Al identificar los cambios de coloración del indicador rédox 2,6-
diclorofenolindofenol.
Se prepara el siguiente kit con 5 tubos de ensayo
Componentes/tubos I II III IV V
Buffer Fosfato 0.1 M pH 7.4 1 0.5 0.5 0.5 0.5
2,6-diclorofenolindofenol 1 1 1 1 1
Succinato 0.1 M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
 Fracción nuclear 0.5
Fracción mitocondrial 0.5
Fracción microsomal soluble 0.5
Homogeneizado total 0.5
Tubo 1: En este tubo de ensayo se encuentra la sustancia buffer, el indicador
(2,6-diclorofenolindofenol) y el sustrato (succinato); al no encontrarse el
complejo enzimático, no se produce reacción, ya que no se puede formar el
complejo E-S, por tanto, tampoco existe formación de producto; esto se
evidencia en que el tubo de ensayo aparece un color azul oscuro.
Tubo 2: En este tubo de ensayo se encuentra la sustancia buffer, el indicador
(2,6-diclorofenolindofenol), el sustrato (succinato) y la fracción nuclear.
Observamos que aparece un color azul oscuro, con lo que podemos deducir
que la fracción nuclear no existen enzimas que se unan al sustrato y forme el
complejo E-S, por lo que no se produce la reacción.
Tubo 3: En este tubo encontramos la sustancia buffer, el indicador (2,6-
diclorofenolindofenol), el sustrato (succinato) y la fracción mitocondrial
(complejo enzimático). Observamos que el color azul oscuro se decolora, lo
que es indicador de que existe una reducción y por tanto se ha producido la
reacción. De esto deducimos que en la fracción mitocondrial si podemos
encontrar enzimas que se unan al sustrato, formen el complejo E-S y por tanto
formen producto.
Tubo 4: En este tubo se encuentra la sustancia buffer, el indicador (2,6-
diclorofenolindofenol) y el sustrato succinato. y la fracción microsomal.
observamos que se tornara de color marrón claro, que indica que no se
produce reacción, debido que en las organelas presentes en la fracción
microsomal, no se encuentra enzimas capaces de catalizar reacciones de
óxido-reducción.
Tubo 5: En este tubo encontramos la sustancia buffer, el indicador, el sustrato
y el homogeneizado total (donde se encuentran todas las fracciones ya
mencionadas). Se observa un cambio de color, ya que el azul se decolora, lo
que nos indica que se ha producido una reducción, por tanto, una reacción.
Esto quiere decir que en el homogeneizado total sí existen enzimas para poder
formar el producto.
4. Al identificar los cambios de coloración del indicador redox p-
fenilendiamina (p-FDA).
Se prepara el siguiente kit con 5 tubos de ensayo
Componente/tubos I II III IV V
Buffer Fosfato 0.1M pH 7.4 1.5 1 1 1 1
p-fenilendiamina 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Fracción nuclear 0.5
Fracción mitocondrial 0.5
Fracción microsomal soluble 0.5
Homogeneizado total 0.5
Tubo I: En este tubo de ensayo encontramos sustancias de buffer y la p-
fenilendiamina que actuará como indicador y sustrato. Observamos lo siguiente
que se torna de un color marrón claro, por lo tanto, este color evidenciará que
no se ha producido reacción, ya que en este tubo de ensayo no existe ningún
complejo enzimático para poder formar el producto.
Tubo II: En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer, p-
fenilendiamina (indicador y sustrato) y la fracción nuclear. Observamos que el
color que aparece en este tubo es el color de marrón claro y comparándolo con
el tubo 1, nos damos cuenta que este color es un indicador que no hubo
reacción, por lo tanto, deducimos que en la fracción nuclear no existen enzimas
para poder llevar a cabo la reacción de óxido reducción y por tanto formar el
producto.
Tubo III: En este tubo de ensayo encontramos buffer, la p-fenilendiamina
(indicador y sustrato) y la fracción mitocondrial (complejo enzimático),
observamos lo siguiente que aparece un color marrón oscuro, lo que indica
que, si se produce formación de producto, por lo tanto, si hay reacción. Debido
a la fracción mitocondrial si existen enzimas para poder el producto y llevar a
cabo la reacción.
Tubo IV: En este tubo de ensayo encontramos la sustancia buffer, la p-
fenilendiamina (indicador y sustrato) y la fracción microsomal. observamos que
existe un color marrón claro, que indica que no se ha formado el producto y por
tanto no se ha producido la reacción. esto debido que en la fracción microsomal
(organelas pequeñas: REL, RER y ribosomas) no existe enzimas capaces de
catalizar reacciones de óxido-reducción.
Tuvo V: En este tubo de ensayo encontramos sustancia buffer, la p-
fenilendiamina (indicador y sustrato) y el homogeneizado total. observamos que
en este tubo el color se torna marrón oscuro debido a que, si produce la
reacción ya que, en el homogeneizado, existe también fracción mitocondrial
donde se encuentra las enzimas.
Referencias

Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of

mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some
biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate
material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).

https://docs.bvsalud.org/biblioref/2018/01/877449/actividad-energetica-y-
hepatoprotectora-de-las-hojas-de-bacchar_TC2qHOa.pdf

http://repositorio.uchile.cl/bitstream/handle/2250/133987/Localizaci%C3%B3n-
subcelular-de-inmunoglobulina-G-en-capa-germinal-de-quistes-hidat
%C3%ADdicos-de-Echinococcus-granulosus.pdf?sequence=1&isAllowed=y