Universidad Nacional Autónoma de México

Facultad de Ciencias
Laboratorio de Biotecnología | Semestre 2023-2

Reporte Práctica #5

“Productos naturales (metabolismo secundario)”

Grupo 5198

Profesora: Katya Dafne Guadarrama Orozco

Alumnos:

● Alcántara Santiago Ana Ximena

● Cedillo Reyes José Angel
● Cilia González Yamile
● Pineda Diaz Moises Isai
● Vargas Álvarez Elba Rebeca

2/mayo/2023
PRÁCTICA 5. Productos naturales

Objetivo:
• Determinar a través de pruebas químicas preliminares la presencia de grupos de
metabolitos secundarios en el extracto hexánico de hoja de planta.
• Determinar el efecto del extracto de la planta sobre el crecimiento de Escherichia coli.

Introducción.

Existen otro tipo de compuestos que se generan de manera paralela con los compuestos
primarios que de acuerdo con sus características particulares y específicas se denominan
compuestos o metabolitos secundarios.

Precursores de todas las vías metabólicas secundarias importantes. Existen tres

precursores principales:

-El ácido shikímico

-Los aminoácidos que dan origen a los alcaloides y a los antibióticos peptídic

-El acetato

Las pruebas específicas para la determinación de grupos de metabolitos secundarios se

llevan a cabo con un extracto de planta y a través de las técnicas colorimétricas y de
precipitación reportadas por Domínguez. Se identifica cualitativamente la presencia o
ausencia de cada uno de los grupos según el cambio de coloración o la precipitación:

• Terpenos: se determinan mediante la prueba de Libermann-Burchard. Si hay presencia

(+) la coloración se torna a azul verdoso/rojo naranja

• Alcaloides: se determinan mediante la prueba de Draguendorff. Si hay presencia (+) la

coloración se torna a pp.naranja o marrón.

• Flavonoides: se determinan mediante la prueba de Shinoda. Si hay presencia (+) la

coloración se torna a verde/ naranja

• Glucósidos: se determinan mediante la prueba de Mölish. Si hay presencia (+) la

coloración se torna a anillo interfase violeta.

Parte I. Determinación de los grupos de metabolitos secundarios

1. Se prepara una solución madre del extracto y se toma 1 ml colocándolo en un tubo de

ensaye, procedimiento que se repite para cada una de las pruebas (5 tubos de ensaye).
2. Se agrega el reactivo que corresponde a cada grupo:

Tubo 1. Control. Sólo se agrega 1ml del extracto.

Tubo 2. Terpenos. El extracto se disuelve en 1 ml de cloroformo concentrado, se agita un

minuto y se deja reposar, si se llegaran a formar dos fases se retira la superior. A la fase
inferior se le agrega 1 ml de reactivo de Libermann-Burchard. Se considera positiva la
prueba si se observa un cambio de coloración al azul-verdoso o rojo-naranja.

Tubo 3. Alcaloides. Al mililitro de extracto se le añade una gota de ácido clorhídrico

concentrado y dos gotas del reactivo Draguendorff. La prueba se considera positiva si se
observa un precipitado de color naranja-marrón.

Tubo 4. Flavonoides. Se le agrega al extracto un trocito de viruta de magnesio (2–4 mm) y

dos gotas de ácido clorhídrico concentrado, si se observa un cambio de coloración hacia el
verde o naranja la prueba se considerará positiva.

Tubo 5. Glucósidos. A 1 ml de extracto se le agrega 1 ml de metanol; después, se le agregan

dos gotas de Mölish. Se coloca el tubo en un baño agua–hielo y se añade 1 ml de H2SO4
concentrado dejando que éste se deslice por las paredes del tubo de ensaye formando así
una interfase. Se toma lectura de la coloración del anillo formado en la interfase, se
considera la prueba positiva si se observa un color violeta.

3. Observar y anotar la presencia o ausencia de los grupos funcionales, de acuerdo al viraje

o precipitado según la prueba.

Parte II. Determinación de la actividad biológica de un extracto de planta

1. Preparar agar nutritivo: Pesar 2.0 g de agar nutritivo y suspender en 90 ml de agua

purificada. Calentar agitando suavemente hasta su completa disolución y esterilizar en
autoclave a 121 grados C a 15 lb de presión por 15 minutos. Dejar enfriar a 45 – 50 grados C.

2. Vaciar 3⁄425 ml del medio en cada una de tres cajas Petri y dejar solidificar.

3. Distribuir, con perlas estériles, 0.2 ml de cultivo líquido de Escherichia coli GM2163.

4. Impregnar los discos de papel filtro con cuatro diferentes cantidades del extracto del
frasco 1 (20, 40, 60) y uno más que será el control positivo, que se impregnará con 20
microlitros de violeta de genciana.

5. Dejar secar los discos por aproximadamente 10 min antes de colocarlos en la caja, para
que se evapore el solvente.
6. Distribuir los cinco discos por caja, separándolos de manera que se alejen lo más posible
entre ellos y del borde de la caja

7. Incubar las cajas por 24 horas a 37 $C.

8. Observar las cajas a las 18 y a las 24 horas y determinar si hubo actividad bacteriostática,
esto es, presencia de un halo de inhibición alrededor de los filtros, con una densidad
celular menor que la presentada en el resto de la caja, asumiendo que esto se debe a la
inhibición parcial del crecimiento bacteriano; o bien bactericida, inhibición total de
crecimiento bacteriano alrededor del disco, observado como un halo transparente.

9. Medir con una regla o Vernier el diámetro de los halos

Resultados.

PARTE 1. Se usaron dos extractos, uno de clavo y otro de orégano, a continuación se

muestra la reacción que se obtuvo de cada una de las pruebas.
Fig 4. Clavo derecho y orégano izq (prueba M) antes y después de sumergirla en hielo. La
solución con clavo se torna rojiza. En ambas aparece un anillo violeta en la interfase, lo que
indica que la prueba es positiva.

Fig 5. Prueba de alcaloides (D). Cuando es positivo es marrón, como sucedió con el orégano
y con el clavo.

TABLA 1. Metabolitos secundarios de la solución con clavo

Grupo Químico Resultado

Terpenos (LB) NEGATIVO

Alcaloides (D) POSITIVO

Glucósidos (M) POSITIVO

Flavonoides (S) POSITIVO

TABLA 2. Metabolitos secundarios de la solución con orégano

Grupo Químico Resultado

Terpenos (LB) POSITIVO

Alcaloides (D) POSITIVO

Glucósidos (M) POSITIVO

Flavonoides (S) NEGATIVO

TABLA 3. Resumen de los resultados para todas las soluciones

Orégano Romero Clavo

Terpenos ✓ x x

Alcaloides ✓ ✓ ✓

Flavonoides x x ✓

Glucósidos ✓ ✓ ✓

PARTE 2.
Fig. 5. Cultivo con E.Coli X con esencia de clavo mostró halos de inhibición que iban
creciendo irregularmente, de acuerdo a la concentración de la esencia del clavo, entre más
alta mayor el radio del halo, el halo con 60 microlitros mostró un Halo de inhibición de
radio de 1.5 cm, el de 40 microlitros de .7 cm el de 20 de su máximo alejamiento fue de 1.1
cm, en el de violeta de genciana que es nuestro inhibidor patrón.

Tabla 3. diámetro de los halos, indicando con un asterisco (*los que tuvieron actividad
bactericida.

Análisis de resultados.

● Parte 1:
Los tubos 1 (controles), nos ayudan a poder comparar los resultados de las reacciones que
se llevaron. Con la tabla 1, podemos observar que el clavo presenta metabolitos
secundarios, como lo son los alcaloides, glucósidos y flavonoides. Mientras que el orégano
dio positivo a los terperones, alcaloides y glucósidos. Las plantas producen metabolitos
secundarios como resultado de la evolución y como una forma de adaptarse a su entorno y
protegerse de los depredadores, patógenos y otros factores estresantes (Dixon, RA y Paiva,
N. 1995).

Algunos de estos metabolitos secundarios, como los alcaloides, los terpenoides y los
flavonoides, tienen propiedades químicas que les permiten interactuar con otros
organismos (Tholl, D. 2015), ya sea para atraer polinizadores, disuadir herbívoros o
defenderse contra patógenos y otros agentes estresantes. Por ejemplo, algunas plantas
producen alcaloides como la cafeína para disuadir a los herbívoros de comer sus hojas o
flores, mientras que otras plantas producen terpenoides como el mentol para atraer a los
polinizadores con su aroma (Guiño, M. 2010), En el caso de el clavo y el orégano, es muy
notorio su olor.

● Parte 2:
Se puede observar que se forman halos alrededor de los papeles, sin embargo pareciera ser
parte del.extracto que pasó al medio, o incluso crecimiento de E coli. Lo anterior debido a
la comparación entre nuestro control (violeta de genciana) y el resto de los papeles con
extracto; conociendo las propiedades antisépticas de violeta contra E coli, sabemos que
debería observarse un halo al rededor de esta, sin embargo tampoco se ve definido, por lo
que tal vez E coli no se desarrolló lo suficiente, o pudo existir otro tipo de error. Sin
embargo sabiendo esto y comparándolos, consideramos que significa que existe un
crecimiento de E coli alrededor de los papeles filtro, ya que observamos una coloración
amarilla, y no una ausencia de ella. Además observamos que al aumentar la concentración
de la esencia de clavo, el crecimiento de E.Coli se extiende sobre más área del agar.

Ahora, si bien, dentro de los metabolitos del clavo, encontramos sustancias como
alcaloides, oxhidrilos fenólicos, y el eugenol (Puche et al., 2017), sustancias que pueden ser
antibacterianas, en el caso de E. Coli, parece no ser suficiente para evitar su crecimiento. Si
bien, algunos autores, como Sethi et al. (2013), mencionan la inhibición de crecimiento de E.
Coli, con extracto de clavo, cabe mencionar que el utilizado en pruebas como la
mencionada, fue extracto metanólico; cuyo procedimiento implica el uso del metanol,
metodología que no se siguió, lo que podría explicar por qué difiere está información con
los resultados que obtuvimos. Otros autores como Costa et al. (2011), nos recuerdan que los
aceites se pueden obtener por distintos métodos, recordando que las cantidades de los
compuestos en cada uno de los procedimientos varía, lo que también pudo haber afectado
en el resultado que nosotros obtuvimos en este experimento.

Conclusión:

En resumen, los metabolitos secundarios son una forma importante en que las plantas
interactúan con su entorno. La producción de estos compuestos puede brindar una ventaja
selectiva. El extracto de clavo demostró un buen poder inhibitorio frente a las cepas
ensayadas a comparación del violeta de genciana.

La identificación de metabolitos secundarios pueden ser características específicas

resultado de patógenos, depredadores a los que están expuestos así como otros factores
ambientales. Su identificación se dió a través de métodos y reactivos diferentes dada la
naturaleza de cada uno de los metabolitos. Ninguna planta tuvo los tres metabolitos, sin
embargo el clavo y el orégano tuvieron tres de los 4 metabolitos. En este orden de ideas,
podemos ver el impacto de estos metabolitos en el crecimiento de E. coli, y considerando
que el clavo tiene propiedades antibacterianas y que en teoría debía inhibir su crecimiento,
debido a tres compuestos específicos: alcaloides, eugenol, oxhidrilo fenólico que
eventualmente llevarían a la muerte de la bacteria, podemos observar que los métodos
podrían afectar las concentraciones de dichos compuestos por lo que lo observado
pareciera contrario a lo que la teoría dice. Como conclusión pudimos identificar los
metabolitos secundarios en tres plantas así como la función que tienen, en las misma
plantas que los producen, por ejemplo actividad antibacteriana.

Bibliografía:

● Guiño, M. (2010). Metabolitos secundarios vegetales: Diversidad, función y

aplicación. Springer Science & Business Media.
● Jones, DA (1998). ¿Por qué tantas plantas alimenticias son cianogénicas?.
Fitoquímica, 47(2), 155-162.
● Kessler, A. y Baldwin, IT (2001). Función defensiva de las emisiones volátiles de
plantas inducidas por herbívoros en la naturaleza. Ciencia, 291(5511), 2141-2144.
● Dixon, RA y Paiva, NL (1995). Metabolismo de fenilpropanoides inducido por estrés.
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● Tholl, D. (2015). Biosíntesis y funciones biológicas de los terpenoides en plantas.
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● Puche, Y. I. P., Villadiego, A. M. D., & Correa, D. A. (2017). Efecto Antimicrobiano del
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Agroindustrial. https://doi.org/10.18684/bsaa(15)56-65
● Becerra, J (s.f). Obtención de extracto metanólico. Materiales y métodos. Tesis.
https://www.google.com/url?sa=t&source=web&rct=j&url=http://tesis.uson.mx/dig
ital/tesis/docs/22612/Metodolog%25C3%25ADa.pdf&ved=2ahUKEwjQxtzK9Nb-AhW3I
EQIHRQCAfkQFnoECC4QAQ&usg=AOvVaw23aD8V1QFztguv_or9RyVR
● Aguilar, A y López, A. (2013). Extractos y aceite esencial del clavo de olor (Syzygium
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https://www.researchgate.net/publication/339310008_Extractos_y_aceite_esencial_
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● Martínez Aguilar, Yordan, Soto Rodríguez, Fernando, Almeida Saavedra, Manuel,
Hermosilla Espinosa, Robinson, & Martínez Yero, Orlando. (2012). Metabolitos
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occidentale L. (marañón). Revista Cubana de Plantas Medicinales, 17(4), 320-329.
Recuperado en 02 de mayo de 2023, de
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1028-47962012000400004&l
ng=es&tlng=es.