INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGÍA

Informe práctica 2
Determinación de constantes cinéticas, Km y Vmax y medición de la actividad
enzimática de enzimas libres.

Grupo: 5BV1

Docentes:

Dr. Oliva Maheda Sergio

Dra. Zamora Contreras Aida Margarita

Equipo 6
Integrantes:
• Carreón Morales Luis Diego.
• Castro Gómez Daniel Alejandro.
• González Calderón Elias Neftali
• López Guadarrama Izamar Sandra
• Palestina Oliva Yesenia Miroslava.
 Entrega: 08.03.2022

Introducción
La relación entre la concentración de enzima y la actividad enzimática, como podría
predecirse, es directamente proporcional, tal que al graficarse se forma una función identidad.
Un aumento en la concentración de enzima representa que se incrementará el número de
elementos para la catalizar una misma reacción, esto a su vez genera que la velocidad de
reacción decrezca. Alterar la concentración de enzima en un porcentaje x ocasiona un cambio
de igual magnitud en la actividad enzimática. La relación antes mencionada es constante
tanto in vivo como en aquellas reacciones in vitro o cualquier otra aplicación biotecnológica
(Robinson, 2015).
Al modificar la concentración de sustrato en la solución donde se encuentra una enzima los
cambios resultan en un comportamiento más complejo; la gráfica no expone una tendencia
lineal, sino hiperbólica. En los ensayos donde se estudia esta modificación se tiene siempre
en cuenta que se mantendrá una concentración de enzima constante. Durante el inicio de la
reacción existe una condición de saturación de sustrato, sin embargo, esto no altera la
cantidad de biocatalizadores que se encargarán de acelerar la reacción, por lo tanto, después
de alcanzar este punto de saturación ningún incremento generará un cambio significativo en
la llamada velocidad máxima (Vmax, misma que corresponde únicamente a la velocidad de
reacción de los primeros instantes de la interacción) (Alberts, 2014, Campbell & Farrell, 2010
y Robinson, 2015).

Objetivos
1. Calcular las constantes cinéticas, Km y Vmax, de una enzima (amilasa).
2. Determinar el efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de las
reacciones enzimáticas.
3. Establecer las velocidades iniciales de una reacción enzimática.

Materiales y métodos

Reactivos Equipo
• Regulador pH 4.7 • Micropipeta automática
• Estufa eléctrica
• Reactivo DNS
• Tubos Eppendorf
• Agua (H2O) • Puntas
• Sacarosa 0.3M • Espectrofotómetro
• Celdas
• Invertasa • Charola de metal
• Flotadores
Ilustración 1. Diagrama de bloques para obtener el efecto de la concentración de enzima

Ilustración 2. Diagrama de bloques para obtener el efecto de la concentración de sustrato

 Resultados
Tabla 1. Resultado de la determinación de la concentración de enzima

Tubo inv
Reg Conc Enz
Sacarosa H2 O 10microg/mL DNS ABS UI
Eppendorf pH 4.7 (mg/mL)
(mL)

Bco 0.2 0.1 0.3 0 0 0.4 0 -3.77142857

1 0.2 0.1 0.28 0.02 0.2 0.4 1.276 360.8

2 0.2 0.1 0.26 0.04 0.4 0.4 1.86 527.657143

3 0.2 0.1 0.24 0.06 0.6 0.4 1.926 546.514286

4 0.2 0.1 0.22 0.08 0.8 0.4 2.431 690.8

5 0.2 0.1 0.2 0.1 1 0.4 2.5 710.514286

y= 0.0007x + 0.0132 x= (y-0.0132) /0.0007

m= 0.0007

b= 0.0132

Gráfico 1. Gráfica del comportamiento de la concentración de la enzima tomando como

datos los valores obtenido de la curva
Tabla 2. Resultado de la determinación de la concentración de sustrato y cálculo de Km y
Vmax por el método de Michaelis-Menten
Sacarosa Reg Inv 50
H2O Conc Sust
Tubos 0.3M pH 4.7 microg/ML DNS ABS UI
(mL) (M)
(mL) (mL) (mL)
Bco 0.2 0.1 0.3 0 0.4 0 0.00006 -3.77142857
1 0.002 0.1 0.47 0.02 0.4 0 0.000000 -3.77142857
2 0.01 0.1 0.47 0.02 0.4 0.00 0.000003 -2.05714285
3 0.02 0.1 0.46 0.02 0.4 0.04 0.000006 9.371428571
4 0.06 0.1 0.42 0.02 0.4 0.21 0.000018 57.08571429
5 0.1 0.1 0.38 0.02 0.4 0.44 0.00003 121.9428571
6 0.2 0.1 0.28 0.02 0.4 0.64 0.00006 179.0857143
7 0.4 0.1 0.08 0.02 0.4 0.82 0.00012 231.6571429

Gráfico 2. Gráfica del comportamiento de la concentración de sustrato utilizando el

modelo de Michaelis-Menten

Tabla 3. Linealización de la curva con respecto a la inversa de los datos para aplicar
modelo de Lineweaver-Burk
Conc Sust 1/Conc Sust
UI 1/UI
(M) (M)
0.00006 -3.771428571
0.0000006 -3.771428571 1666666.667 -0.265151515
0.000003 -2.057142857 333333.3333 -0.486111111
 0.000006 9.371428571 166666.6667 0.106707317
0.000018 57.08571429 55555.55556 0.017517518
0.00003 121.9428571 33333.33333 0.008200562
0.00006 179.0857143 16666.66667 0.005583918
0.00012 231.6571429 8333.333333 0.004316724

Gráfico 3. Gráfica del modelo de Lineweaver-Burk para el cálculo de Km y Vmax con base
en la concentración de sustrato

Tabla 4. Cálculo de Km y Vmax con base en los resultados obtenidos a partir del modelo
de Lineweaver-Burk

Y=mx+b Y= 0.0000007x – 0.0094

km/Vmax 0.0000007
1/Vmax 0.0094

Vmax 106.38 UI
km 0.00007 M

Análisis y discusión
La actividad de la concentración de enzima en la invertasa fue determinada por la reacción
de azúcares reductores con DNS. Usando el blanco como referencia, tiene todos los reactivos
y en la misma concentración, pero sin contener el elemento que se determinó, se usó para
colocar en cero de absorbancia el espectrofotómetro. Teniendo un mayor valor de unidades
de invertasa en el tubo Eppendorf 7 con una absorbancia de 2.5 a 540 nm. Teniendo una
relación con la ley de Lambert-Beer en un rango 0-40mM de concentraciones de glucosa.
De manera general se observa en la gráfica 1 que al ir añadiendo una mayor cantidad mg/mL
de concentración de enzimas, hay una mayor disponibilidad de las mismas. Por lo cual
aumenta la concentración de la cantidad de azúcares reductores pues las enzimas se saturan
menos y trabajan mejor. Es por eso que se aprecia como la concentración final de azúcares
reductores es incrementada de manera lineal conforme aumenta la concentración de enzima.
Se nota en el primer punto de la gráfica como a poca concentración de enzima, la UI
(unidades de invertasa) es pobre debido a que la cantidad de enzima supera a la cantidad de
sustrato, obteniendo poca cantidad de azúcares reductores.
Sin embargo, al apreciar la gráfica más a detalle destaca que el punto 2 y 4 se alejan un poco
de la línea de tendencia, esto puedo deberse a: error en la toma de las muestras.
La invertasa facilita la hidrolisis descomposición de la sacarosa en monómeros de hexosa
para cumplir con la planta requerimientos fisiológicos para transportar carbohidratos, estrés
respuesta y la señalización del azúcar (Roitsch & González, 2004).
La tabla 2 muestra las absorbancias obtenidas en cada uno de los puntos de la cinética de
hidrólisis de sacarosa a diferentes concentraciones de sacarosa inicial, se observa que la
concentración de glucosa va aumentando conforme también se va utilizando mayor
concentración de sacarosa. Se obtuvo una concentración máxima de glucosa de 0.00012 M y
un valor mínimo de 0.00006 M, de acuerdo a las concentraciones iniciales de sacarosa de 0.4
y 0.2 mL respectivamente, demostrando que se obtendrá más producto entre más
concentración inicial de sustrato se agregue.
Cuando la concentración de enzima se mantiene constante, la adición de más sustrato
aumentará la velocidad de la reacción. Si la concentración de sustrato es alta, puede saturar
todas las moléculas de la enzima, entonces la velocidad de la reacción alcanza su máximo y
la adición de más sustrato no aumenta más la velocidad de la reacción. (ITS Paysandú, 2020)
La gráfica 2 muestra el modelo de Michaelis-Menten, obtenido a partir de graficar la
concentración de sustrato y la velocidad de la reacción, expresada en unidades de invertasa;
de acuerdo al modelo se observa que a medida que se emplea una mayor concentración de
sacarosa el valor de actividad de la invertasa es mayor también. Se obtuvo un valor máximo
de actividad de invertasa de 231.65 UI y un valor mínimo de –3.77 UI, demostrando que
entre menor concentración inicial de sustrato exista en la reacción, menor será la actividad
de la enzima, por lo que la velocidad también será menor.
La gráfica 2 muestra una curva hiperbólica, donde se observa que en los primeros puntos el
incremento de la actividad de invertasa es más acelerado y proporcional, sin embargo para
los puntos finales el incremento es más moderado, ya que no se puede exceder la velocidad
máxima, y llegado a este punto la velocidad se mantiene constante.
La tabla 3 establece los valores de las constantes cinéticas: velocidad máxima (Vmax) y
constante de Michaelis (Km), para el método de Lineweaver-Burk, donde se grafica el
inverso de la velocidad de reacción en unidades de invertasa (1/UI) y el inverso de la
concentración de sustrato (1/Conc Sust), con el objetivo de linealizar el modelo previo. En la
gráfica 3 se observa un coeficiente de relación de 0.9706 (debido al agluinamiento inicial de
los valores de sustrato a bajas concentraciones) y una ecuación de recta de y= 0.0000007x –
0.0094, cuyo resultado ajustado al modelo cinético representa un valor de Km/Vmax =
0.0000007 y 1/Vmax = 0.0094. Al realizar los despejes pertinentes se obtiene un valor de
constantes cinéticas de Vmax = 106.38 UI y Km = 0.00007 M (Tabla 4).
La linealización es un método eficaz para aproximar la salida de una función y=f(x) a
cualquiera x=a basado en el valor y la pendiente de la función en x=b, por lo tanto, los
métodos que se validan de un gráfico y un modelo matemático caracterizado por una
linealización (Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee y Dixon) serán más precisos que un método
que solo está validado por un análisis gráfico. Por lo que podemos intuir que el Modelo de
Michaelis-Menten es el menos exacto, ya que carece de un sustento más que gráfico y puede
tener errores de mala interpretación de los valores de Km y Vmáx.

Conclusiones
• Se calcularon las constantes cinéticas, Km siendo de 7𝑥10−5 M y Vmax con un
valor de 106.38 UI de la enzima
• Se determinó el efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de las
reacciones enzimáticas.
• Entre más cantidad de concentración de enzima, aumentan los azúcares reductores.
• La actividad de invertasa libre aumenta conforme también se emplea una
concentración inicial de sacarosa mayor, presentándose un comportamiento
hiperbólico
• El Modelo de Michaelis-Menten es el menos exacto, ya que carece de un sustento
más que gráfico y puede tener errores de mala interpretación de los valores de Km y
Vmáx.
• El perfil de la actividad de la invertasa respecto a la concentración de enzima es
lineal creciente y la máxima actividad invertasa obtenida es a la concentración de
invertasa de 710.514286 UI
• La concentración de invertasa es proporcional a la actividad enzimática; siempre y
cuando sea esta el único factor limitante en la reacción, mientras exista el suficiente
sustrato la actividad enzimática continúa incrementando proporcionalmente.

Bibliografía
• Alberts, B. (2014). Molecular biology of the cell (6a ed.). Garland Publishing.
• Campbell, M. K., & Farrell, S. O. (2010). Biochemistry (7a ed.). Brooks/Cole.
• Robinson, P. K. (2015). Enzymes: principles and biotechnological applications.
Essays in Biochemistry, 59(0), 1–41. https://doi.org/10.1042/bse0590001
• Roitsch, T., & González, M. C. (2004). Function and regulation of plant invertases:
sweet sensations. Trends in Plant Science, 9(12), 606-613.
http://dx.doi.org/10.1016/j.tplants.2004.10.009. PMid:15564128
• ITS Paysandú, Química Bio-Orgánica. (2020). Factores que afectan la actividad
enzimática. 17/10/2021, de Consejo de Educación Técnico Profesional Sitio web:
https://uruguayeduca.anep.edu.uy/sites/default/files/inlinefiles/Factores%20que%20
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• Bioquimica experimental. (S. F.). Factores que modifican la actividad de las
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https://bioquimexperimental.files.wordpress.com/2009/08/seccic3b3n3-sustrato-e-
inhibidor-final.pdf
• Cho, Y.-S. (2018). Comparison of various estimation methods for the parameters of
Michaelis–Menten equation. Transl Pin Pharmacol, 1, 39-47.
http://dx.doi.org/10.12793/tcp.2018.26.1.xx