UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTÍN DE AREQUIPA

FACULTAD DE CIENCIAS BIOMÉDICAS Y AGROPECUARIAS 

 
ESCUELA PROFESIONAL DE AGRONOMÍA 

Asignatura: BIOQUÍMICA

EFECTO DE CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO: DETERMINACIÓN DE Km y

Vmax DE LA FOSFATASA ÁCIDA DE QUINUA

Docente: FREY FRANCISCO, ROMERO VARGAS

Presentado por:

● LOPEZ CONDORI LILI YASMINI

             PERU-MAJES-PEDREGAL-2022
FOSFATASA ÁCIDA DE QUINUA

Las enzimas son moléculas proteicas especializadas, que

aceleran las reacciones químicas llevándolas más rápidamente
a su posición de equilibrio.

Las fosfatasas ácidas denominadas también Monoéster

Ortofosfórico Fosfohidrolasa, actúan en un rango de pH entre
5.0 y 6.5, hidrolizan sustratos que tienen un enlace fosfoéster,
liberando como productos de la reacción fosfato inorgánico y
un alcohol, el cual varía dependiendo del sustrato utilizado.
Estas enzimas no necesitan de metal alguno para evidenciar su
actividad.

Son varios los factores que afectan la actividad enzimática, haremos mención de alguno de ellos:
1. EFECTO DEL TIEMPO. La cantidad de producto formado en una reacción
enzimática es proporcional al tiempo de incubación. La reacción es lineal en el tiempo hasta un
período determinado en que se puede expresar la actividad enzimática en términos de velocidad,
o sea la cantidad de producto formado por unidad de tiempo. Generalmente la velocidad se
expresa en micromoles de producto formado por minuto.

2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE ENZIMA. Cuando el sustrato se

encuentra en exceso, a concentraciones saturantes, la velocidad de la reacción es proporcional a
la concentración de la enzima.

3. EFECTO DEL pH. La mayor parte de las enzimas tienen un pH característico en el

cual su actividad es máxima, a ese pH se le denomina pH óptimo, y se define como el pH en el
cual la enzima y el sustrato presentan una conformación estructural adecuada para la actividad
catalítica. Por encima y por debajo de este pH la actividad declina, adoptando una forma
característica de campana.

4. EFECTO DE LA TEMPERATURA. La velocidad de las reacciones catalizadas por

enzimas generalmente se incrementa con la temperatura dentro del margen de estabilidad y
plena actividad de la enzima. Cuando la temperatura alcanza un cierto valor, variable, según la
enzima que se trate, esta empieza a desnaturalizarse y la velocidad de la reacción empieza a
disminuir. La temperatura a la que se alcanza ese valor máximo se denomina temperatura
óptima.

5. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO. Es el más importante, ya

que determina la velocidad de la reacción. En la mayoría de los casos, cuando se representa la
velocidad en función de la concentración de sustrato, manteniéndose constante la concentración
de enzima, se obtienen curvas hiperbólicas en las cuales puede observarse que para valores muy
pequeños de concentración de sustrato [S], la velocidad de reacción es directamente
proporcional a la concentración del propio sustrato.
 PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO.
1. MATERIAL
- Tubos de ensayo
- Pipetas
- Gradillas
- Espectrofotómetro
- Baño maría a 37 °C
- Buffer Acetato de Sodio 0.1 M pH 5
-2 -3
- Sustrato: p-Nitrofenilfosfato 1 x 10 M y 1 x 10 M
- Enzima: Fosfatasa ácida
- NaOH 1 N

2.

PROCEDIMIENTO:

Prepare un sistema de tubos por duplicado tal como se indica a continuación:

Conc. Inicial de p-NO2ϕ-P 1 x 10-2 M 1 x 10-3 M

Conc. Final de p-NO2ɸ-P 1x10-3 B 5x10-4 B 2x10-4 B 1x10-4 B 5x10-5 B
Buffer Acetato 0.1 M pH 5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
0.2 0.2 0.1 0.1 0.4 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1
(ml) p-NO2∅-P (ml) 0.7 0.8 0.8 0.9 0.5 0.6 0.7 0.8 0.8 0.9
Agua Destilada (ml)
Preincubar 2 min a 37 °C 0.1 - 0.1 - 0.1 - 0.1 - 0.1 -
Enzima
Incubar 3 min a 37 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
°C NaOH 1 N (ml)

Leer en espectrofotómetro a 400 nm.

CÁLCULOS
Coeficiente de Extinción Molar del p-Nitrofenol: 1.8 x 104 M-1 cm-1

DATOS EXPERIMENTALES
Anotar las absorbancias para cada concentración de sustrato utilizada

ABSORBANCIAS Abs Velocidad [p-Nitrofenol]

Neta µMoles/min 1/ µMoles/min Moles 1/[p-Nitrofenol]
Blanco Tubo 1 Tubo 2

0.424 0.847 0.894 0.447 2.48x10-2 40.314 10x10-4 1000

0.240 0.520 0.737 0.389 2.16 x10-2 46.332 5x10-4 2000

0.115 0.431 0.246 0.224 1.24 x10-2 80.537 2x10-4 5000

0.089 0.152 0.276 0.125 0.69 x10-2 144.000 1x10-4 10000

0.039 0.127 0.188 0.119 0.65 x10-2 151.899 0.5x10-4 20000

RESULTADOS, DISCUSIÓN, CONCLUSIÓN, BIBLIOGRAFÍA

Presente figuras de velocidad frente a concentración de sustrato (Diagrama de Michaelis-Menten), y 1/V

frente al 1/[S] (Diagrama de Lineweaver-Burk). A partir de ésta última determina Km y Vmax. Analice los
resultados anote sus conclusiones.

CONCENTRACION ([S] x 10-4 )

[p-Nitrofenol] Velocidad
Moles µMoles/mi
n

10x10-4 2.48x10-2
5x10-4 2.16 x10-2
2x10-4 1.24 x10-2
1x10-4 0.69 x10-2
0.5x10-4 0.65 x10-2
 1/ 1/
([p-Nitrofenol] (Velocidad
Moles) µMoles/mi
n)

1000.000 40.323
2000.000 46.296
5000.000 80.645
10000.000 144.928
20000.000 153.846

KM Vmax
2.13x10 2.53x10-2
-4
CUESTIONARIO
Describa el mecanismo de la reacción enzimática de la fosfatasa ácida.

Los fosfatos ácidos son enzimas que tienen un pH ácido (alrededor de 5,0) Propiedades que catalizan la
hidrólisis de fosfomonoster y liberan productos La reacción de fosfatos inorgánicos y alcoholes, cuya
naturaleza depende del sustrato utilizado.

1. Se ha determinado la velocidad inicial de una reacción catalizada enzimáticamente

para diversas concentraciones de sustrato. Los datos obtenidos son los siguientes:

[S] (mol/L) V [(mol/L) min-]

5 22
10 39
20 65
50 102
100 120
200 135
Estime Vmax y Km utilizando las representaciones gráficas de Michaelis-Menten y
Lineweaver-Burk

2. El efecto de la temperatura en la hidrólisis de la lactosa mediante una ß-galactosidasa

se muestra a continuación. Calcular la energía de activación y también Q10.

T Vmax
(°C) (uM/min/mg de proteína)
20 4.50
30 8.65
35 11.80
40 15.96
45 21.36
3. Se estudia la cinética del estado estacionario de una enzima en ausencia y en presencia
de un inhibidor (inhibidor A). La velocidad inicial viene dada en función de la
concentración de sustrato en la siguiente tabla:

V[(mmol/L)-1
min-1]
[S] Sin Inhibidor Inhibidor Inhibidor
(mmol/L) inhibidor A B3 B5
mM mM
1.25 1.72 0.98 1.25 1.01
1.67 2.04 1.17 1.54 1.26
2.5 2.63 1.47 2.00 1.72
5.00 3.33 1.96 2.86 2.56
10.00 4.17 2.38 3.7 3.49

a) ¿Qué tipo de inhibición produce el inhibidor A?

Se produce sencillamente porque el inhibidor se une con la enzima de forma que no afecta a la
configuración del centro activo, por lo que se puede unir sin problemas con el sustrato, pero
afecta de forma significativa su actividad.

b) Determina Vmax y Km en presencia y ausencia del inhibidor A

Para determinar gráficamente los valores de KM y Vmax es más sencillo utilizar la Inhibidor:
Efector que se une al enzima y hace disminuir su actividad,.

c) Qué tipo de inhibidor es el inhibidor B?

Se clasifican en base al efecto producido por la variación de la concentración del
sustrato de la enzima en el inhibidor. Inhibición competitiva. Dos (o más) sustratos
no se pueden unir al mismo tiempo al centro activo de la misma enzima de la que
ambos (o todos ellos) son sustratos

d) Determine Vmax y Km para cada concentración del inhibidor B

Los términos Vmax (velocidad máxima) y Km (constante de Michaelis) son dos
parámetros cinéticos característicos de cada enzima, que pueden determinarse
experimentalmente.
e) Estime Ki a partir de estos datos.

La esquematización lo podemos visualizar en la parte de arriba del informe

 Práctica sobre la actividad enzimática de la
catalasa
Materiales y métodos
La propuesta experimental es de naturaleza cualitativa y con fines didácticos.

Materiales necesarios para realizar la actividad

● Papa cortada en cubitos (1.5 x 1.5 cm)
● Agua oxigenada 40% o peróxido de hidrógeno – H2O2
● Jeringa de plástico de 5 ml
● Siete vasitos transparentes descartables o tubos d ensayo para acondicionamiento de los materiales a
ser probados.
Cocimiento de la papa Conducción del
experimento
Enumerar los tubos de ensayo y en cada uno de ellos, colocar los alimentos a ser probados (tratamientos),
conforme a la tabla. En cada uno de ellos deberán ser llenados con 1 ml de agua oxigenada. Después de llenar
el ultimo tubo (control de la reacción), anotar los resultados ocurridos en cada uno de ellos, formula
hipótesis.
Tabla 1. Tubos de ensayos enumerados y llenados con agua oxigenada en los alimentos a ser probados.

Numeración de Tratamientos
tubos o vasos
1 Cubitos de papa cruda + 1ml de H2O2
2 Cubitos de papa cocida + 1 ml H2O2
3 Cubitos de papa tratada con ácido acético + 1 ml de H2O2
4 Cubitos de papa tratada con hidróxido de sodio + 1 ml de H2O2
5 Cubitos de papa tratada con CuSO4 + 1 ml de H2O2
6 Cubitos de papa cruda oxidados 20 min + 1 ml de H2O2
7 Control con apenas 1 ml de H2O2
 Cuestionario
1. Describe con detalle lo que ha ocurrido en cada uno de los vasos o tubos. Desarrolla una
hipótesis para explicar los resultados en cada uno de los vasos.

La papa contiene una enzima llamada" catalasa" que es un potente antioxidante. Al introducirla en el
agua oxigenada, lo que hace esta enzimas separar el agua del oxígeno

H202-H2O+1/2 02

Es decir, la catalasa acelera la reacción de descomposición del agua oxigenada, que podemos apreciar
con el burbujeo que se produce. Estas burbujas se originan por la rápida liberación de gas (02) en agua
(H2O).

2. ¿Cuál es la función de la enzima catalasa en los seres vivos? Explica tu respuesta.

La catalasa es una enzima antioxidante presente en la mayoría de los organismos aerobios. Cataliza la
dismutación del peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno. La mayoría de estas enzimas son
homotetrámeros con un grupo hemo en cada subunidad.

3. Explica en términos generales lo que ha ocurrido en el vaso de precipitados nº 1 (patata cruda +

peróxido de hidrógeno) y escribe la reacción global de la descomposición de peróxido de hidrógeno.

En la realización de este experimento pude observar claramente la enzima de catalasa en la papa y como
influyen los distintos factores como la temperatura o el pH, y también las reacciones que ocurren con los
distintos reactivos utilizados.

Al introducirla en el agua oxigenada, lo que hace esta enzima es separar el agua del oxígeno:
H202---->H2O+1/2 O2 Es decir, la catalasa acelera la reacción de descomposición del agua oxigenada, que
podemos apreciar con el burbujeo que se produce. El agua oxigenada y la reacción de su descomposición,
H2O2 (ac) → H2O (l) + ½ O2 (g) , ΔH0 =−196,4 kJ . Esta reacción es además una reacción de desproporción
redox en la que el oxígeno contenido en la molécula de peróxido de hidrógeno se oxida y se reduce al mismo
tiempo

4. Cuando tenemos un hematoma y sangramos, al añadir agua oxigenada a la lesión, observamos

la aparición de burbujas efervescentes. Como ¿se puede relacionar este fenómeno con lo que vimos en
la lección experimental con la patata? Explica tu respuesta.

Las papas reaccionan con peróxido de hidrógeno, vierta peróxido de hidrógeno en una botella de
vidrio y luego pedimos unas patatas crudas. Las burbujas se formaron instantáneamente en la
superficie de la patata. Cuando te lastimas y viertes peróxido de hidrógeno en la herida, la catalasa
es desconocida. Por supuesto, la fuente de peróxido está encendida. Así aparecen las burbujas y la
espuma.