06 de marzo del 2023 

 
 
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GENERAL  
PRÁCTICA # 9 
CINÉTICA ENZIMÁTICA 1: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL
SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Integrantes del equipo: 

● Abril Payan Gastelum – 216354 
● Itzel Janeth Lucero Ramírez 224283 
● Jennifer Denisse Cardenas Mendez 224105 
● Abraham Macías Vicuña 229117 

ÍNDICE
Introducción
Objetivos
Materiales y métodos
Resultados
Discusión
Conclusión
Cuestionario
Bibliografía

ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS

Figura 1. Ecuación de Michaelis-Menten
Figura 2. Gráfica de Michaelis-Menten.
Figura 3. Resultados de la reacción con dinitrosalicilato en la serie de tubos del 1
al 6.
Figura 4. Gráfica de MM para la actividad enzimática de la invertasa según los
datos obtenidos en el laboratorio.
Figura 5. Gráfica de Lineweaver-Burk, se observa la ecuación de la recta del lado
superior.
Tabla I. Tabla de los materiales y reactivos empleados.
Tabla II. Datos de velocidad inicial según la concentración de sustrato.
Tabla III. Datos recíprocos de [S] y Vo resultantes de la actividad enzimática de la
invertasa para el análisis de Lineweaver-Burk.

INTRODUCCIÓN
La cinética química es el estudio que se encarga de estudiar la velocidad de
reacción y del cómo cambia la velocidad de reacción al tener diferentes variables
la velocidad es expresada con tiempo, al tomar la velocidad es importante tomar la
velocidad cada que cambia ya que al paso de la estabilidad el cambio de la
velocidad de reacción es igual a cero.
La cinética de Michaelis-Menten describe la velocidad de reacción de muchas
reacciones enzimáticas pero dicha cinética solo aplica cuando la concentración del
sustrato es mayor a la concentración de la enzima y dependiendo del tipo de
reacción enzimática se puede obtener diferente resultado.

Figura 1. Ecuación de Michaelis-Menten

Como se puede ver en la Figura 1., aparece la ecuación de Michaelis-Menten esta

es capaz de determinar la velocidad de reacción de una enzima al variar el
sustrato. 

Figura 2. Gráfica de Michaelis-Menten.

Michaelis determinó la nombrada constante de Michaelis (km) que establece la

afinidad de una enzima con el sustrato, también observó que al aumentar la
cantidad de sustrato la velocidad aumentaba hasta cierto punto que la enzima se
saturaba y ya no aumentaba más la velocidad de reacción es decir su velocidad
máxima (Vmax) (García Herránz & López-Pastor, 2015).
Esta gráfica muestra la velocidad (v) que muestra la cantidad de sustratos que se
convierten en producto por segundo y con concentraciones crecientes de sustrato
la enzima alcanza su velocidad máxima (vmax) pero nunca la alcanza por eso no
hay valor determinado para vmax además de esto se puede determinar otro
parámetro característico que sería usando la cantidad de sustrato a la cual llega a
la mitad de la velocidad máxima (1/2 Vmax) en este punto la cantidad de sustrato
es igual a Km (García Herránz & López-Pastor, 2015).

OBJETIVOS
El alumno observará el comportamiento de la actividad enzimática de acuerdo con
los parámetros de concentración tanto del sustrato determinando los valores de:
a) Vmax (velocidad máxima de la reacción).
b) 1/2 Vmax
c) Km (constante de Michaelis).
d) [S] óptima (concentración óptima de sustrato).

MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
2 pipetas de 10ml
1 pipeta de 5ml
6 pipetas de 1ml
2 propipetas verde
3 propipetas azules
Celdas de espectrofotómetro
1 piseta
Reactivos
Solución de invertasa 0.001%
Buffer de fosfatos 4.7 ph
Solución de 3.5 dinitrosalicilato
Sacarosa 0.02M, 0.03M, 0.05M,
0.1M, 0.3M y 0.5M

Tabla I. Tabla de los materiales y reactivos empleados.

 Se coloco cada reactivo según la tabla en 6 tubos de ensayo.

 Después se enumeraron los tubos.
 Luego se puso en la incubadora por 20 minutos.
 Después de incubar se le puso a cada uno 1ml de dinitrosalicilato 
 Una vez puesto el dinitrosalicilato se llevó a calentar en el plato
caliente. 
 Para después llevarlos a checar en el espectro fotómetro.

RESULTADOS
 Figura 3. Resultados de la reacción con dinitrosalicilato en la serie de tubos del 1 al 6.

En la figura 3 es posible apreciar los resultados de la reacción del dinitrosalicilato

con los productos de la actividad enzimática de la invertasa sobre la sacarosa.
Cabe señalar que la serie de tubos fueron incubados a 35°C, por 20 minutos, para
posteriormente ser tratadas con el dinitrosalicilato. Como se puede apreciar, el
dinitrosalicilato al reaccionar produjo una coloración que ronda los tonos
anaranjados. Por otro lado, es importante señalar que el tubo 6 es un blanco, por
lo que su coloración corresponde simplemente al color del DNS al no contener el
sustrato (sacarosa) y, por ende, productos (fructosa y glucosa) con lo que
reacciona el dinitrosalicilato.
Concentración V (As)
0.02 0.39
0.03 0.675
0.05 0.988
0.1 1.048
0.3 1.449
Tabla II. Datos de velocidad inicial según la concentración de sustrato.

Con los datos obtenidos de velocidad inicial la cual conseguimos asumiendo que
es la absorbancia ya que a mayor absorbancia mayor velocidad, se realizó la
Tabla II cuyos datos son necesarios para la elaboración de la gráfica de Michaelis-
Menten observada a continuación en la Figura 4.
Figura 4. Gráfica de MM para la actividad enzimática de la invertasa según los datos obtenidos en
el laboratorio.

Gracias al modelo de Michaelis-Menten, es posible generar la curva de saturación

parabólica observada en la Figura 4. En dicha curva, se observa la relación entre
la velocidad inicial y la concentración de sustrato y además nos permite predecir la
Vmax y KM.
Se procedió a hacer un análisis con el diagrama de Lineweaver-Burk, el cual
corresponde a los recíprocos de los datos de [S] y Vo usados anteriormente, y
resultando en la Tabla III:
1/[S] 1/[Vo]
50 2.564102564
33.33333333 1.481481481
20 1.012145749
10 0.954198473
3.333333333 0.690131125
Tabla III. Datos recíprocos de [S] y Vo resultantes de la actividad enzimática de la invertasa para el
análisis de Lineweaver-Burk.

De esta forma, se estructuró una gráfica de Lineweaver-Burk con ayuda de Excel,

como se muestra en la Figura 5.

1/[Vo] vs. 1/[S]

3

2.5
f(x) = 0.0380655680134879 x + 0.45221529157223
2 R² = 0.923298317389812
1/[Vo]

1.5

0.5

0
0 10 20 30 40 50
1/[S]

Figura 5. Gráfica de Lineweaver-Burk, se observa la ecuación de la recta del lado superior.

Con las gráficas y datos anteriores fueron utilizados para poder analizar la Vmax y
la KM. Con ayuda del profesor, se obtuvo la ecuación de la recta. Y que nos
permite concluir lo siguiente:
1) m=y2-y1/x2-x1; m=3.7821
2) 𝑉𝑚𝑎𝑥=1.7969
 3) 𝑚 = 𝐾𝑀 / 𝑉𝑚𝑎𝑥; es decir, la pendiente corresponde al
cociente de la constante de Michaelis entre la velocidad
máxima
Tomando las afirmaciones anteriores, se calcularon la Vmax y KM, resultando en
que:
• Siendo Vmax= 1.7969
• Teniendo que 𝑚 = 𝐾𝑀 / 𝑉𝑚𝑎𝑥 entonces, 𝐾𝑀= 𝑚 ∗ 𝑉𝑚𝑎𝑥, tal que KM
= 0.072[M]

DISCUSIÓN
El estudio realizado en este artículo es sobre la actividad enzimática de dos
enzimas comerciales Celulasa y Viscozime L, actividad celulasa y pectinasa. Ellos
realizaron curvas patrones de sus productos de las reacciones, de las cuales se
obtuvieron gráficas en las que se observó su comportamiento a diferentes pH,
temperatura y concentraciones de sustrato, como resultado las condiciones
óptimas para catalizar las reacciones de celulasas y pectinasas. La dependencia
del pH se debe a los cambios en los estados de ionización de los aminoácidos del
sitio activo de la enzima. Al momento de realizar los cálculos con la Celulasa su
pH óptimo fue de pH 5, dando como resultado de la temperatura óptima 60°C,
realizaron los cálculos de la ecuación de Lineweaber-Burk les arrojó el resultado
de Max=0.07181 mg/mL*min y km= 0.42803 mg/mL, haciendo que el resultado
indicara que la velocidad máxima de la enzima y la afinidad de la enzima por su
sustrato sea baja ya que km es baja; con la enzima Viscozime el pH fue más alto
de lo que debería haber dado, en cambio la temperatura si fue la óptima y en la
ecuación de Lineweaber-Burk ocurrió lo mismo que con la Celulasa (Cruz, 2013).

Los resultados experimentales que realizaron de velocidad en estado estacionario

frente a la concentración de sustrato indican que un gran número de enzimas se
desvían del comportamiento michaeliano. Los estudios en estado estacionario
detectan estas desviaciones a partir de gráficas a vs. y',' o 1/a vs. 1/y". Se han
establecido criterios para poder dilucidar a qué grado con respecto al sustrato está
correspondiendo la velocidad, los factores que multiplican a la concentración de
sustrato son expresiones algebraicas de las k^, la determinación de sus valores
nos permite conocer cuál va a ser la influencia de cada término en la ecuación y
saber a qué etapa se debe en concreto el que ese término sea significativo o no.
En el caso sencillo de un mecanismo 1:2 queda claro cómo a partir de la
determinación de las X^ puede obtenerse esta información. En mecanismos más
complejos sería conveniente utilizar la expresión de T para el cálculo de k
mediante regresión no lineal. Un requisito experimental viene impuesto por la
necesidad de medir pequeños niveles de productos de reacción, lo que obliga a
usar sustratos con características apropiadas (alto coeficiente de extinción, alta
solubilidad, etc.), y elevadas concentraciones de enzima (Varón Castellanos,
Tudela Serrano, García Carmona, & García Cánovas, 1985).

CONCLUSIÓN
En conclusión, con la práctica, obtuvimos buenos resultados al momento de llevar
los tubos de ensayo a la parrilla, pudimos notar que en cuestión de minutos
cambió de color la reacción, pudimos deducir que el cambio de temperatura si es
un factor importante porque rápidamente al aplicarle calor está aumento la
velocidad de reacción. Y de nuevo al fotocolorímetro pudimos sacar lo que fue la
concentración de cada tubo.

CUESTIONARIO
1. - La velocidad inicial de una reacción enzimática es dependiente
exclusivamente de la cantidad de sustrato presente, si, no, ¿por qué?
No, por qué existen múltiples factores que influyen sobre los índices de reacciones
catalizadas por enzimas como la temperatura y el pH. Se dice que el incremento
de la temperatura aumenta el choque o la interacción entre los sustratos y las
enzimas por lo que aumenta la velocidad de reacción, sin embargo, si la
temperatura aumenta demasiado, la energía cinética de la enzima aumenta
también llegando al grado de desnaturalización de esta por la alteración de los
enlaces covalentes que mantienen su estructura tridimensional (Voet, Voet, &
Pratt, 2007).

2. - ¿Cuál es la diferencia entre los cambios de energía libre que existen entre un
proceso catalizado por una enzima y el mismo proceso no catalizado?
El cambio de energía libre no cambia en una reacción catalizada, solamente
reduce su energía de activación (Khan Academy, 2017).

3. - ¿Por qué a concentraciones de sustrato mucho mayores que el valor de la Km

la velocidad de la reacción es independiente de la concentración de sustrato?
La velocidad de reacción depende claramente de la concentración de sustrato, sin
embargo, lo hace hasta cierto punto. En el momento en el que la reacción llega al
estado de saturación de la reacción, por más concentración que haya de sustrato,
la velocidad ya no se modificará debido a que el proceso se encuentra en un tope
en el que la velocidad solo pudiera incrementar si incrementa la cantidad de
enzimas, sin embargo, si recordamos, la cantidad biológica enzimática dispuesta
para la reacción se encuentra ya determinada (Kennelly & Rodwell, 2016).

4. - La Km de una enzima varía con la concentración de enzima, si, no, ¿por qué?
No. La Km es característica de una enzima y particular para un determinado
sustrato y refleja la afinidad de la enzima por el sustrato, por lo tanto, es un
parámetro invariable de la enzima. Es decir, si se tiene una enzima y un sustrato y
la afinidad del sustrato es mínima, por gigantesca que sea la concentración del
sustrato, la enzima no creará una mayor de afinidad por el sustrato (Kennelly &
Rodwell, 2016).

BIBLIOGRAFÍA