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Institutito Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Métodos de Análisis

Francisco Carmelo Fernández López

12/10/2020 4IM02

Nahui Ollin Morales López

“Determinación de Proteínas por el Método del Ácido

Bincinconínico (BCA)”
Nahui Morales López 2

1. Objetivos

• Elaborar una curva de calibración para la cuantificación de proteínas


empleando un método fotométrico.
• Conocer el efecto de sustancias no proteínicas sobre el desarrollo de la
reacción colorida.
• Determinar si existen diferencias estadísticamente significativas en la
precisión y exactitud entre los métodos de Bradford y del BCA.
• Analizar las ventajas y desventajas del método del BCA, con respecto a otros
métodos para la cuantificación de proteínas.

2. Fundamento de la Práctica
Está basado en el principio de reducción de iones cúpricos a iones cuprosos debido
a las proteínas en un medio alcalino. Los iones cuprosos reaccionan con el BCA
formando un compuesto de coordinación púrpura [Cu(BCA)2] para ser leído a 562
nm.

3. Resultados y Cálculos

Tabla 1. Curva de calibración de albúmina

Concentración de proteína A 562


Tubo no. (µg/mL) Serie a Serie b
1 2 0.139 0.114
2 4 0.222 0.231
3 6 0.323 0.321
4 8 0.416 0.386
5 10 0.499 0.504

Absorbancia vs Concentración
0.6

0.5
y = 0.0462x + 0.0381
R² = 0.9938
Absorbancia

0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración µg/mL
Nahui Morales López 3

Las variables de la ecuación obtenida de la curva pueden interpretarse como:


y= 0.0462 x + 0.0381; R= 0.9968
y= absorbancia
m= pendiente positiva
x= concentración
b= absorbancia del blanco
Cuando la absorción tiene un comportamiento lineal y proporcional con respecto a
la concentración, se dice que se cumple con la ley de Bouger y Beer para este caso
dentro de nuestros limites de cantidad de proteína que van de 2 a 10 µg/mL.
Derivado de la recta ajustada por regresión lineal y la ecuación obtenida, se llegó a
la siguiente ecuación para el cálculo de proteína.
y-b/m= x sustituyendo los valores: y-0.0381/0.0462 = x
II. Análisis estadístico

Tabla 2. Replica para el análisis estadístico tubo 3


Concentración de proteína
Tubo no. A 562 (µg/mL)
1 0.317 6.0367
2 0.359 6.9458
3 0.316 6.0151
4 0.298 5.6255
5 0.324 6.1883
6 0.305 5.7770
7 0.346 6.6645
8 0.294 5.5389
9 0.341 6.5562
10 0.313 5.9502

Tabla 3. Resultados del análisis estadístico


_
x Sx S2x % C. V IC de µ Precisión% Exactitud%
∑𝒏𝒊=𝟏 𝑿𝒊 ∑𝒏𝒊=𝟏(𝑿𝒊− ̅̅̅̅̅
̅̅
𝑿)̅̅𝟐 𝑺𝒙 ̅̅̅̅̅̅̅̅̅̅
𝒕𝑺𝒙
(𝟏𝟎𝟎) ̅±
𝑿
𝒏 𝒏−𝟏 ̅
𝑿 √𝒏
6.1298 0.4617 0.2132 7.53 [5.799,6.460] 92.47 97.83

Ea = 6.1298-6 = 0.1298 Vi= 6. 1298, Ve= 6


%Er = Ea/Ve = 2.1633% %Exactitud = 100-Er %Precisión = 100-% C.V
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III. Efecto de sustancias no proteínicas en el método de BCA


Tabla 4. Efecto de sustancias no proteínicas en el método de BCA
Tipo de
Concentración de interferencia
Tubo No. Sustancia A 562 proteína (µg/mL) generada
1 Fenol 0.2% 0.338 6.4913 positiva
2 Detergente comercial 0.2% 0.324 6.1883 no hay
3 SDS al 0.2% 2.161 45.9502 positiva
4 Mercaptoetanol al 0.002% 2.404 51.2099 positiva
5 EDTA 30 mM 0.002 0.7813 negativa

Se considera como interferencia a cualquier dato fuera del intervalo de confianza y


comparando con los datos bibliográficos sabemos que para el método del BCA las
sales de buffer y detergentes no iónicos así como las concentraciones del medio de
reactivos desnaturalizantes no interfieren en la reacción, por el contrario de los
azúcares reductores y las altas concentraciones de sulfato de amonio que si
presentan interferencia.
Por esto el SDS al ser un detergente iónico desnaturaliza a la proteína causando
interferencia, el Mercaptoetanol por su habilidad para separar puentes disulfuro
también desnaturaliza a la proteína y muestra interferencia, y por último se observa
interferencia con el EDTA debido a su naturaleza como agente quelante.
¿Qué contiene el Reactivo A y B y en que proporciones?
Reactivo A: BCA 1%, Na2CO3 2%, tartrato sódico 0,16%, NaOH 0,4% y NaHCO3
0,95%. Ajustar a pH 11,25 con NaOH.
Reactivo B: CuSO4 al 4%

IV. COMPARACIÓN DE LOS MÉTODOS UTILIZADOS PARA CUANTIFICAR


PROTEÍNAS
MÉTODO VENTAJAS DESVENTAJAS
• NO ES MUY SENSIBLE
• RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN COMPARADO CON EL MÉTODO
MENOS DE 30 MINUTOS) DE LOWRY
• POCAS SUBSTANCIAS NO • LAS CONCENTRACIONES ALTAS
PROTÉICAS INTERFIEREN CON LA DE SALES DE AMONIO
REACCIÓN DE BIURET INTERFIEREN CON LA REACCIÓN
• NO DETECTA N2 DE FUENTES NO • REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg
PROTÉICAS O NO PEPTÍDICAS DE PROTEÍNA POR PRUEBA
BIURET
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• LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS


TAMBIÉN ABSORBEN EN LA
• MÉTODO RÁPIDO Y REGIÓN DE 280nm
RELATIVAMENTE SENSIBLE • EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS
AROMÁTICOS DIFIERE
(VARIAS VECES MÁS SENSIBLE
CONSIDERABLEMENTE EN
QUE EL MÉTODO DE BIURET)
VARIAS PROTEÍNAS
• NO EXISTE INTERFERENCIA DEL • LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E
SULFATO DE AMONIO Y OTRAS INCOLORA. LA TURBIDEZ PUEDE
SALES BUFFER PRODUCIR RESULTADOS
A 280 nm • MÉTODO NO DESTRUCTIVO ERRÁTICOS
• EL COLOR VARÍA CON
DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS
QUE EL MÉTODO DE BIURET)
• LA SACAROSA, LÍPIDOS,
BUFFERS FOSFATO,
MONOSACÁRIDOS Y
HEXOAMINAS INTERFIEREN CON
• MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA LA REACCIÓN
DE LOS OTROS MÉTODOS • LAS ALTAS CONCENTRACIONES
• MUY SENSIBLE DE AZÚCARES REDUCTORES,
• SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 SULFATO DE AMONIO Y
HORAS COMPUESTOS CON
SULFHIDRILO INTERFIEREN CON
• MENOS AFECTADO POR LA
LA REACCIÓN
LOWRY TURBIDEZ DE LA MUESTRA
• NO EXISTE INTERFERENCIA DEL
SULFATO DE AMONIO
• NO EXISTE INTERFERENCIA DE
LOS POLIFENOLES NI
CARBOHIDRATOS COMO LA
SACAROSA
• MIDE PROTEÍNA O PÉPTIDOS
• MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN SE CON UNA MASA MOLECULAR
PUEDE COMPLETAR EN 2 MINUTOS) APROXIMADAMENTE IGUAL O
• NO EXISTE INTERFERENCIA DE MAYOR DE 4 000 DALTONS
BRADFORD CATIONES COMO K+, Na+, Y Mg+
• EL COLOR NO ES ESTABLE CON
EL TIEMPO. SE NECESITA
• SENSIBILIDAD COMPARABLE A LA CONTROLAR CUIDADOSAMENTE
DEL MÉTODO DE LOWRY (0.5mg a EL TIEMPO ENTRE EL ANÁLISIS Y
10mg) LA LECTURA EN ABSORBANCIA.
• LAS SALES DE BUFFER Y • LOS AZÚCARES REDUCTORES
DETERGENTE NO IÓNICO NO INTERFIEREN CON LA
INTERFIEREN CON LA REACCIÓN REACCIÓN.
• LAS CONCENTRACIONES DEL • ALTAS CONCENTRACIONES DE
MEDIO DE REACTIVOS SULFATO DE AMONIO
DESNATURALIZANTES NO INTERFIEREN CON LA
INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl REACCIÓN.
BCA O UREA 3M)
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4. Discusión
Utilizamos la curva de calibración como un método para determinar la concentración
de albúmina, obteniendo un comportamiento lineal y proporcional con respecto a
esta, en este método espectrofotométrico podemos saber que tan sensible es
interpretando la pendiente de la curva de calibración como la sensibilidad del
método, teniendo una menor pendiente hay una mayor sensibilidad y viceversa,
sabemos que con la ecuación obtenida de la curva de calibración se determinó la
concentración para el análisis estadístico del cual podemos observar que se obtuvo
una media muy cercana al valor esperado, así como una desviación estándar y
coeficiente de variación un poco altos teniendo una dispersión considerable entre
los datos, esto puede ocurrir debido a errores de medición y por ende se obtiene
una precisión baja. Comparando con la exactitud podemos observar que está fue
mayor al tener un error absoluto pequeño.
En las sustancias no proteínicas (tabla 4) se cuantificó la concentración para
diferentes sustancias obteniendo valores mayores o menores del índice de
confianza, podemos observar que los valores fueron positivos para detergentes
ionizantes y reductores de puentes disulfuro (SDS, Mercaptoetanol) y negativos
para agentes quelantes (EDTA), este último presenta una absorbancia tan pequeña
que se obtiene un valor negativo, muy cercano al cero. Consultando la bibliografía
podemos observar que el método del BCA al tener una alta estabilidad del reactivo
y el cromóforo proporciona un método para la cuantificación de proteínas que es
sencillo, rápido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a compuestos que
afectan a otros métodos.
5. Conclusiones

• Se obtuvo una pendiente positiva cumpliendo la ley de Bouger y Beer


• Se obtuvo una exactitud del 97.83% y precisión del 92.47
• Las interferencias que afectan al método fueron SDS al 0.2%,
Mercaptoetanol al 0.002% y EDTA 30mM
• El método del BCA muestra una gran tolerancia a compuestos que afectan a
otros métodos.
• Presenta una sensibilidad similar al método de Lowry
• La flexibilidad del método propuesto en términos de formulación y
estadísticamente es un resultado directo de la estabilidad del reactivo BCA y
su cromóforo de cobre.

6. Referencias Bibliográficas
Fernández, E. (s.f.). “Métodos para la cuantificación de proteínas.” Departamento
de Bioquímica y Biología Molecular. Obtenido de
Nahui Morales López 7

http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/acym/27_METODOS_PARA_LA_CUANTI
FICACION_DE_PROT EINAS.pdf
Skoog., D. (2014.). “Fundamentos de química analítica”. Ciudad de México.:
Cengage.
Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985): “Measurement of protein
using bicinchoninic acid”. Anal Biochem 150: 76-85
Mairin, J. (2015). “Bioquímica General: Fundamentos y Análisis de Laboratorio”.
Ecuador, UTMACH.