Taller Técnicas de laboratorio en bioquímica 2: CINÉTICA

ENZIMÁTICA

MATERIA: Bioquímica

GRUPO : 4

INTEGRANTES:

- Alejo Campos, Silvia Rocio

- García Alpiste, Nayeli Norit
- Monge Aviles, Angye
- Muñoz Sovero, Eliane Anat
- Nakagawa Meza, Hiromi Fiorella
- Solier Lopez, Katherin
- Tirado Bistolfi, Ariadna

Coordinador:

- Zimic, Mirko

I. OBJETIVOS
 1. Estudiar la cinética de la enzima fosfatasa alcalina: Determinación de las constantes
catalíticas Km y Vmáx de la enzima.
2. Analizar el efecto de la variación de pH y temperatura sobre la actividad enzimática.

II. INTRODUCCIÓN

Dentro del organismo de cualquier ser vivo existen los conocidos “catalizadores biológicos”, que
por lo general son proteínas, pero existen incluso en forma de ARN. Son producidas por nuestro
propio genoma (autocatalíticos), y básicamente su función es acelerar las reacciones químicas,
modificando la velocidad de reacción sin alterar la variación de Gº o la Keq de la reacción. La
forma en la que actúa la enzima es muy específica; puesto que, se requiere una cierta cantidad
para determinada concentración de sustrato y trabajan bajo condiciones como el pH,
temperatura, cofactores, entre otras. Hay que resaltar que toda reacción química tiene como
objetivo inherente alcanzar el equilibrio, por lo que la enzima no modifica los límites, solo
contribuye con la velocidad.
En el presente laboratorio se trabajó con “fosfatasa alcalina”, la cual es una enzima que
hidroliza un enlace éster fosfato, obteniendo como producto un alcohol y un derivado fosfatado.
Se calcularán los valores de los parámetros cinéticos, así como también se verá el efecto de la
variación de dos condiciones, como pH y temperatura sobre la actividad enzimática.

III. DESARROLLO

A. MEDIDA DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS

Se usaron 7 tubos que contenían distintas concentraciones de sustrato p-NFF, la concentración

de la enzima se mantuvo constante, así como también el tiempo de incubación que fue de 5
minutos.
Posteriormente, la reacción fue detenida con 200 uL de NaOH 3N y se realizó las mediciones
de absorbancia a 405 nm.

Unidades de enzima. Para el siguiente experimento, la enzima utilizada fue la fosfatasa

alcalina intestinal bovina. La solución de trabajo es una dilución 1/20 000 de la original (10
000 U/ml) (1 U equivale a 1umol de producto formado/min a 37 oC a pH 9.8). ¿Cuántas unidades
de la enzima se utilizó por reacción?

● Solución de trabajo= 1/20000 x 10000 U/mL = 0.5 U/mL

● Unidades de enzima= Solución de trabajo x Volumen

=0.5 U/mL x 5uL = 2.5 x 10❑−3 U

a) Cálculo de la concentración de sustrato:

Se calculó la concentración de sustrato para cada tubo.

Tubo 1:
● Ci x Vi = Cf x Vf
(2 mg/mL ) x (10 μL) = (X) x (1250 μL)
Cf= 0.016 mg/mL

Molaridad:
M = [S] g/L
(PM del sustrato)
0.016 mg/mL → 0.016 g/L

0.016
M=
371.1

M= 0.000043 x 10❑3= 0.043 mM

● Tubo 2:
Ci x Vi = Cf x Vf
(2 mg/mL) X (25μL) = Cf X (1250μL)
Cf= 0.04 mg/mL

Molaridad:
M = [S] g/L
(PM del sustrato)
0.04 mg/mL → 0.04 g/L

0.04 g/ L −4
M= =1.07 X 10 M
371.1
M=1.07 X 10−4 M → 0.107mM

● Tubo 3:
Ci x Vi = Cf x Vf
(2 mg/mL) X (50μL) = Cf X (1250μL)
Cf= 0.08 mg/mL

Molaridad
0.08
M=
371.1

M= 0.000215 x 10❑3= 0.215 mM

● Tubo 4:
Ci x Vi = Cf x Vf
(2 mg/mL) X (75μL) = Cf X (1250μL)
Cf= 0.12 mg/mL
● Molaridad
M = [S] g/L
(PM del sustrato)
0.12 mg/mL → 0.12 g/L
 0.12 g /L
M= =0.000323
371.1

0.000323 x 10❑3= 0.323 mM

● Tubo 5:
Ci x Vi = Cf x Vf
(2 mg/mL) X (100μL) = Cf X (1250μL)
Cf= 0.16 mg/mL

0.16 g / L
M= =0.000431
371.1

0.000431 x 10❑3= 0.431 mM

● Tubo 6:
Ci x Vi = Cf x Vf
(2 mg/mL) X (200μL) = Cf X (1250μL)
Cf= 0.32 mg/mL

Molaridad
M = [S] g/L
(PM del sustrato)
0.32 mg/mL → 0.32 g/L

0.32 g /L −4
M= =8.62 X 10 M
371.1
M=8.62 X 10−4 M → 0.862mM

● Tubo 7:
Ci x Vi = Cf x Vf
(2 mg/mL) X (400μL) = Cf X (1250μL)
Cf= 0.64 mg/mL

Molaridad
M = [S] g/L
(PM del sustrato)
0.64 mg/mL → 0.64 g/L

0.64 g/ L −3
M= =1.72 X 10 M
371.1
M=1.72 X 10−3 M → 1.72 mM

b) Calcular la velocidad de la reacción:

Para hallar la velocidad de reacción, primero se empleó la Ley de lambert-Beer para hallar la
concentración del producto (p-nitrofenol); luego se multiplicó por el volumen para obtener el
número de moles y luego este fue dividido entre el tiempo de la reacción

- T1
0.159 −6 −3 −8
c= =8.6885 M × 10 ×1.45 ×10 L=1.2598 ×10 moles
18300 x 1
−8 6
1.2598 ×10 moles × 10 =0.012598 μ moles
0.012598 μ moles −3
V= =2.51967× 10 μ moles/min
5 min

El resto de velocidades fueron halladas en una hoja de cálculo (Tabla 1).

Tabla 1. Cálculo de la velocidad a partir de los valores de absorbancia del p-nitrofenol.

c) Completar la siguiente tabla con los datos obtenidos.

ΔA Vo
pNFF (μl) [S] (mM) 1/[S] 1/Vo
405 nm ( μmol/min)
10 0.159 0.043 2.52 x 10−3 23.256 396.877
−3
25 0.297 0.107 4.71 x 10 9.346 212.4695
−3
50 0.367 0.215 5.82 x 10 4.65 171.944
−3
75 0.413 0.323 6.54 x 10 3.096 152.7929
100 0.433 0.431 6.86 x 10−3 2.32 145.7354
200 0.485 0.862 7.69 x 10−3 1.159 130.11
400 0.522 1.724 8.27 x 10−3 0.579 120.8878

Tabla 2. Parámetros cinéticos de la fosfatasa alcalina intestinal bovina.

d) Graficar en excel según los resultados obtenidos:

- Velocidad vs. Concentración de Sustrato (v vs [S]) ¿Cómo se denomina esta

gráfica? ¿Qué tipo de curva es?
Gráfica de Michaelis-Menten, el tipo de curva es hiperbólica.
 Grafica 1. Curva hiperbólica de la relación de la velocidad vs. concentración de sustrato.

- Determine el Km y Vmáx de la fosfatasa alcalina mediante el gráfico de Lineweaver-

Burke (1/v vs 1/[S]).

Gráfica 2. Gráfico de Lineweaver- Burke

Los valores de velocidad y km:

1
● Vmax= =8.75 ×10−3 μ mol /min
114.19
● Km=12.008× Vmax=0.105 μ mol
CUESTIONARIO

a) ¿Cómo se interpreta y qué importancia tiene el valor de Km?

Es un parámetro que ayuda a conocer que nivel de afinidad tiene la enzima por su sustrato,
pues a menor Km, mayor afinidad al sustrato; también se le puede definir como concentración
de sustrato que se necesita para alcanzar el 50% de la velocidad de la reacción.

b) ¿Qué utilidad tiene la determinación de los parámetros cinéticos de las enzimas?

Los parámetros cinéticos son herramientas que nos permiten evaluar el rendimiento de las
enzimas y su utilidad se basa en determinar a qué condiciones las enzimas tienen un
funcionamiento óptimo. Nos ayudan a estudiar el comportamiento de las enzimas frente a
diversas condiciones y evaluar los procesos biológicos de las mismas.

c) Explique la importancia fisiológica de la fosfatasa alcalina en los diferentes tejidos.

La fosfatasa alcalina se encuentra en casi todos los tejidos del cuerpo, específicamente en
la membrana celular, es una enzima hidrolasa que tiene poca afinidad por el sustrato y
ayuda a diferentes niveles en situaciones fisiológicas:
- Esta enzima alcanza su mayor actividad en la época de crecimiento de una persona,
pues se encuentra en los osteoblastos, el cual sintetiza colágeno .
- En el hígado, la fosfatasa alcalina se encuentra en los bordes de las células que se unen
para formar los conductos biliares, los cuales ayudan al paso de la bilis.

B. EFECTO DE LA VARIACIÓN DE TEMPERATURA

Se usó las condiciones del tubo 8 (T7), donde la velocidad fue mayor. Se usó los valores de
absorbancia a 405 nm para hallar la velocidad a diferentes temperaturas.

Temperatur Absorbancia Velocidad

a 405nm (mmoles/min)
4°C 0.126 0.001997
Ambiente 0.522 0.00827
37°C 0.724 0.01147
100°C 0.211 0.003343
Tabla 2. Valores de absorbancia a 405 nm y velocidades a diferentes temperaturas.

a) Grafique Actividad Enzimática vs. Temperatura.

 Gráfica 3. Actividad enzimática vs. Temperatura.

b) ¿A qué temperatura tiene mayor actividad la enzima? Explique por qué.

A 37 grados tiene mayor actividad enzimática. Esto es debido a que esa es la temperatura
óptima y eso se evidencia en el incremento de la actividad enzimática.

C. EFECTO DE LA VARIACIÓN DE pH

Se usó las condiciones del tubo 8 (T7), donde la velocidad fue mayor. Se usó los valores de
absorbancia a 405 nm para hallar la velocidad a diferentes pH.

pH Absorbancia Velocidad
(405nm) (mmoles/min)
6 0.225 3.57 ×10−3
8 0.337 5.34 ×10−3
9 0.520 8.24 ×10−3

Tabla 3. Valores de absorbancia y velocidad de T7 a diferentes pH.

 Tabla 4. Cálculo de la velocidad a diferentes pH.

Gráfica 4. Actividad
enzimática vs. ph

La actividad enzimática depende del pH, en la gráfica mostrada podemos observar que a
medida que el pH tiende a ser alcalino, este aumenta su velocidad.

IV. DISCUSIÓN

Las fosfatasas alcalinas (EC 3.1.3.1) pertenecen al grupo de las metaloenzimas de zinc y dado
a que catalizan diversas reacciones se les conocen como una superfamilia. Las fosfatasas
alcalinas se encargan de dividir a los grupos fosfatos de los ésteres de fosfato orgánico
encontrados en las membranas de las células. Estas enzimas actúan mejor en un pH alcalino,
de ahí proviene su nombre (Pérez et al., 2016).

En los adultos humanos, la fosfatasa alcalina se encuentra en mayor proporción en el hígado,

seguido del hueso y el sistema reticuloendotelial y vascular (Cétola, 2000). Debido a esto
presentan varias isoenzimas que solo difieren en la secuecia de aminoacidos pero catalizan la
misma reaccion; podemos indentificar cinco isoenzimas principales: la hepática, la ósea, la
placentaria, la intestinal y la inducida por glucocorticoides (Pérez et al., 2016).

Las fosfatasas catalizan la hidrólisis del p-nitrofenil-fosfato, obteniendo como producto el p-

nitrofenol que absorbe a los 405 nm de longitud de onda (Mercado et al., 2012) Por este motivo,
en la primera parte del experimento se usó diferentes concentraciones del sustrato p-nitrofenil-
fosfato para evaluar la velocidad de las reacciones. Para hallar las concentraciones finales del
sustrato usamos una relación de equivalencias entre las concentraciones y volúmenes iniciales
y finales.
Dado que el producto p-nitrofenol absorbe a 405 nm, se usaron los valores de absorbancia de
los distintos tubos que se nos proporcionaron para hallar las velocidades a diferentes
concentraciones de sustrato. Dentro de los parámetros hallados se observa que a medida que
aumenta la concentración del sustrato aumenta la velocidad de la reacción, al realizar las
gráficas de los datos, estos se acomodan a la curva hiperbólica de Michaelis-Menten y la
transformación lineal de Lineweaver-Burke.

Al evaluar el efecto de la temperatura en la actividad enzimática se encontró que la velocidad

máxima de la reacción fue a 37 oC. Dado que la temperatura corporal de los mamíferos varía
entre 36 y 39 oC es de esperarse que la fosfatasa alcalina intestinal trabaje óptimamente a
temperaturas dentro de ese rango. A temperaturas extremas, la velocidad disminuye
sustancialmente. Si las temperaturas son muy elevadas las enzimas tienden a denaturalizarse,
una característica propia de las proteínas.

El pH óptimo para la fosfatasa alcalina se encuentra entre 9 y 10 (Bárcena et al, 2007). En el

experimento realizado se observa que la velocidad de la reacción va aumentando a medida que
el pH aumenta, a pH 9 se encuentra la mayor velocidad. Las cadenas laterales de aminoácidos
actúan como ácidos o bases débiles de acuerdo al grado de ionización que presenten
cumpliendo funciones en el sitio activo de la enzima y manteniendo las estructuras de las
enzimas por medio de interacciones no covalentes (Nelson & Cox, 2019).

Conocer los niveles de fosfatasas alcalinas séricas nos ayuda a identificar anomalías en el
funcionamiento de la enzima y posibles enfermedades que esté desarrollando un organismo. Se
identifican dos tipos de afecciones principales: la enfermedad ósea y la hepatobiliar. Niveles
altos y moderados de fosfatasa alcalina indican enfermedades óseas como la de Paget y
cánceres óseo osteogénico, osteomalacia y raquitismo, si el último es tratado con vitamina D se
puede recuperar los valores normales de fosfatas alcalina sérica (Costa, s. f.). Por otra parte,
las principales causas de la disminución del nivel de fosfatasas alcalinas son el cretinismo,
déficit de vitamina D e hipofosfatasia (Costa, s. f.).

El aumento fisiológico de la fosfatasa alcalina es común en la etapa crecimiento de los

animales, durante la fase de curación de fracturas óseas y en hembras gestantes por acción de
la fosfatasa alcalina de la placenta (Bárcena et al., 2007). La fosfatas alcalina puede ser usada
para el control de adecuada pasteurización de la leche y crema, debido a que se inactiva por
calentamiento (Bárcena et al., 2007).

V. CONCLUSIONES

- Las fosfatasas alcalinas son una superfamilia de enzimas que se encargan de catalizar
reacciones en diversos tejidos, posee diferentes isoenzimas entre ellas se encuentra la
fosfatasa alcalina intestinal, en esta práctica se analizó la actividad enzimática de la
enzima proveniente de bovino.
- Tanto como la concentración de sustrato, la temperatura y el pH son determinantes para
el óptimo funcionamiento de esta enzima.
- Existen diversas implicaciones fisiológicas de la fosfatasa alcalina en los organismos,
entre ellas se encuentran el crecimiento, para la curación de fracturas y durante la
gestación; medir los niveles de fosfatasa sérica es importante para la detección de
anomalías del tipo óseo y hepatobiliar.

VI. BIBLIOGRAFÍA
Bárcena, J. Garcia, C. Padilla, C. Martínez, E. & Díez, J. (2007). Caracterización cinética de la
fosfatasa alcalina. Recuperado de:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/30%20FOSFATASA%20ALCALINA.pdf

Cétola, V. (2000). Fosfatasas Alcalina. Wiener Laboratorios. Argentina. Recuperado de

https://www.wiener-lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20espanol/
fosfatasas_alcalina_optimizada_sp.pdf

Costa, J. (s. f.). Fosfatasa alcalina. LINEAR CHEMICALES. España. Recuperado de

http://www.linear.es/ficheros/archivos/6_1102015C.pdf

Mercado, G. Duarte, N. Álvarez, E. De la Rosa , L. & Wall, A. (2012). Fosfatasa alcalina

(E.C.3.1.3.1): bioquímica y aplicaciones en las ciencias biomédicas, ecológicas y alimentarias.
Tecnociencia. Chihuahua 6(2):112-122. Recuperado de:
https://vocero.uach.mx/index.php/tecnociencia/article/view/681/746

Nelson, D. & Cox, M. (2019). Lehninger. Principios de Bioquímica. Séptima edición. OMEGA.
ISBN: 978-84-282-1667-8

Pérez, R. Nasello, W. & Murno, G. (2016). Fosfatasa alcalina, su interpretación clínica-

patológica. Facultad de Ciencias Veterinarias. UNCPBA. Recuperado de
https://www.ridaa.unicen.edu.ar/xmlui/bitstream/handle/123456789/524/PEREZ%2C
%20GEORGINA.pdf?sequence=1&isAllowed=y