FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

CURSO: BIOTECNOLIGIA DE LOS P.A.I.

TEMA:

DETERMINACIÓN

DE

LOS

PARÁMETROS

CINÉTICOS DE UNA ENZIMA

INTEGRANTES:

  

MEDINA GARCIA, SANDRA ANNA LUCY MINCHOLA GUTIERREZ, ROSMER EDGAR VILLANUEVA CHUNQUE, YONEL GABRIEL

CICLO: IX

TRUJILLO – PERÚ 2011

OBJETIVOS Conocer los parámetros de la actividad enzimática Observar el comportamiento de una reacción enzimática en un extracto crudo vegetal. pH del medio. INTRODUCCIÓN En los diversos compartimientos celulares transcurre un gran número de reacciones químicas que proporcionan a la célula energía y los componentes necesarios para su mantenimiento. Toda reacción enzimática puede esquematizarse como sigue: La velocidad de una reacción catalizada por un enzima depende de 1. la concentración de moléculas de sustrato [S] 2. que afecta a la conformación (estructura espacial) de la molécula enzimática II. que son proteínas específicas denominadas enzimas. la presencia de inhibidores 4. Determinar la Vm y Km de la enzima extraída de papaya . la temperatura 3. Las reacciones químicas en los sistemas biológicos sólo ocurren en presencia de catalizadores.DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE UNA ENZIMA I. La presencia de una enzima se detecta por las reacciones específicas que cataliza.

Representacion de la doble reciproca de la velocidad de reaccion . Una de las transformaciones se obtiene tomando los dobles reciprocos de ambos miembros de la ecuación de MichaelisMenten Ecuación de Lineweaber-Burk Determinación de las constantes de Lineweaber-Burk La representación grafica de este modelo permite identificar la Km y Vmax. Figura 1.III. MARCO TEORICO Modelo de Lineweaber-Burk La ecuación Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas que son mas útiles para la expresión de los datos experimentales. Tal representación doble-recioprica tiene la ventaja de que permite una determinación mucho mas exacta del valor Vmax ya que las representación sencilla de Vo frente a la concentración del sustrato en la curva de Michaelis Menten solo se obtiene por su valor aproximado puesto que es un valor limite a una concentración del sustrato infinita. el punto de corte ciob el eje de ordenadasd es equivalente a la inversa de Vmax. y el de abscisas es el valor de -1/Km.

Km es la constante de Michaelis. Representación grafica de la velocidad de reacción y constantes de Vmax y Km de Eadie-Hofsteen.Modelo de Eadie-Hofsteen Ota aplicación útil de la ecuación de Michaelis-Menten se obtiene multiplicando ambos miembros de la ecuación Lineweaber-Burl por V y reordenándola se obtiene la ecuación de Eadie-Hofsteen Ecuación de Eadie-Hofsteen Determinación de constantes de Eadie-Hofsteen La representación de Vo frente a Vo/[S] se conoce como la representación de EadieHofsteen.Menten. debido a que asigna el mismo peso a todos los puntos para cualquier rango de concentración del sustrato o de la velocidad de reacción. Figura 2. Donde Vo representa la velocidad de la reacción. Este diagrama permite visualizar rápidamente los parámetros cinéticos importantes como Km y Vmax a la vez que esta menos afectada por el margen de error que el diagrama de Lineweaver-Burke. .

6 1.8 mg/ml Almidon 1 1.1 0.5 0.4 4 2 1 2.067 0.9919 Figura N°01: Curva de calibración del almidón .5 0.8 5 2.621 0.5 0.1 0.5 0.5 2.4 0.5 1.5 2.5 0.8 0.484 1 Curva de Calibracion 1.5 0.1 0 0 1 0.884 0.1 1.4434x R² = 0.4 0.1 1.4 1.2 1 ABS 0.6 B 0 3 2.2 0 0 0.6 0. RESULTADOS 1.5 2. DETERMINACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN Tabla N°01: Valores de absorbancia y concentración de almidón Componentes Sustrato de almidón Agua deshidratada HCl 0.5 0.IV.1 N Solución Yodada Absorbancia mg de Almidón Tubos 3 1.295 0.2 y = 1.6 0.1 0.5 2.2 2 1 2 2.2 0.

14942497 0.144 0.4 0.2 0.30092836 0.144 0.14942497 0.144 0.01504642 0.4 0. residual e hidrolizado TUBO Blanco * Problema1 Problema2 Problema3 Problema4 Problema5 ABS 0 0.143 0.6 0.316 0.02501178 0.50023555 0.073 0.02905362 0.316 0.1ml) (100ml) 0 0 0.21892753 0.03011639 15.00747125 7.073 0.50023555 0.09907164 0.143 0. DETERMINACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE MICHAELIS MENTEN (Km y Vmáx) Muestra: Papaya Tabla N°02: Valores de Absorbancia.574 mg de Almidón 0 0.8 1 Almidón Almidón USC USC residual hidrolizado (0.2 0.073 0.2. TUBO Blanco * Problema1 Problema2 Problema3 Problema4 Problema5 ABS 0 0.47124844 0.316 0.316 0.05057503 0.143 0.30092836 0.0464182 25.58107247 0.05057503 0.60232784 0.60232784 Tabla N°03: Valores de velocidad y de cantidad de sustrato inicial.073 0.09907164 0.144 0.09976445 0.574 mg de Almidón 0 0. almidón residual y velocidad.0117777 29.58107247 0.143 0.0536234 30.39767216 0.574 C 0 0.6 0.21892753 0.574 C 0 0.39767216 0.1163919 .8 1 Almidón Almidón residual hidrolizado 0 0 0.09976445 0.

02 0.2 Figura N°02: Diagrama de velocidad de reacción y constante de Michaelis-Menten Tabla N°04: Valores de los parámetros de Michaelis Menten y valor de R2 Vmax Vmax/2 Km R2 0.36 0.025 V 0.015 0.04 0.0208 y = -0.0208 0.035 0.005 Vm=0.8 1 1.2 0.0416 0.0237x2 + 0.03 0.36 0 0 0.0416 Vmax/2=0.6 S 0.1) REPRESENTACIÓN DE MICHAELIS MENTEN 0.01 0.9838 .0653x R² = 0.2.9838 Km=0.045 0.4 0.

614x + 1. velocidad y de sus respectivas inversas PAPAYA Veloc./min) 0 0.71392875 1/Vmáx Vmáx 2 0.) 0 0.2 0.2) REPRESENTACIÓN DE LINEWEAVER – BURK Tabla N°05: Valores de cantidad de sustrato.Burk 120 100 1/V 80 60 40 20 0 0 2 1/S 4 6 y = 20.5 1.040155189 [S]inicial (mg.033349037 0.98587336 25.614 14.9912 Figura N°03: representación de Lineweaver – Burk Tabla N°06: Valores de Vmáx.3848294 49.051x R² = 0.4007 0. Km y R2 1/V=(Km/Vmáx)x(1/S)+(1/Vmáx) y = 19.25 1 1/V 100.84575007 29.666666667 1. (mg.81433613 24.038738165 0.2.4 0.0029985 Km/Vmáx Km 1.009961665 0.4007 19.8 1 1/S 5 2.6 0.9919 R ./ml.90338164 Representación de Lineweaver .020061891 0.

Hofstee 0.06 0.038738165 0.009961665 0.(1/Km)*V Tabla N°07: Valores de cantidad de sustrato.2 0.020061891 0.038738165 0./min) 0 0.03 0.02 0./ml.4 0.) 0 0.04 V/S 0. velocidad y de velocidad/sustrato PAPAYA Veloc (mg.0531 R² = 0.05 0.020061891 0.8 1 V/S 0.3) REPRESENTACIÓN DE EADIE HOFSTEE V/S = Vmáx/Km .009961665 0.040155189 Representación de Eadie .6 0.15x + 0.01 0.040155189 [S]inicial (mg.1235 Figura N°04: Representación de de Eadie Hofstee .03 0.05 Series1 y = -0.05558173 0.01 0 0 0.02 V 0.2.033349037 0.033349037 0.04 0.04842271 0.04015519 V 0.04980832 0.05015473 0.

009961665 0.8 1 S/V 20.038738165 0.8 1 .6514689 24.4) REPRESENTACIÓN DE LANGMUIR S/V = Km/Vmáx + S*(1/Vmáx) Tabla N°09: Valores de cantidad de sustrato.2 0./ml.354 Vmáx 6.0531 Vmáx/Km 0.) 0 0.0531 0.1235 R 2.90338164 S 0.020061891 0.Tabla N°08: Valores de Vmáx.(1/Km)*V y = -0.07696588 19. velocidad y de sustrato/velocidad PAPAYA Veloc (mg.2 0./min) 0 0.4 0. Km y R2 V/S= Vmáx/Km .033349037 0.040155189 [S]inicial (mg.666666667 Km 2 0.15x + 0.99152402 20.4 0.6 0.93830003 17.6 0.15 1/Km 0.

192938453 Vmáx 3.603 R² = 0.6 S 0.183x + 17.4 0.603 17.4137 R .8 1 1. Km y R2 S/v=(Km/Vmáx)+S*(1/Vmáx) y = 5.4137 Series1 Figura N°05: representación de Langmuir Tabla N°10: Valores de Vmáx.603 Km/Vmáx 5.Representación de Langmuir 30 25 20 S/V 15 10 5 0 0 0.183x + 17.2 y = 5.396295582 Km 2 0.2 0.183 1/Vmáx 0.

15 0.0100 0.5 -0.5 1 1.18 0.0387 0.5 S 2 2.02 0 0.2.4 -0.04 0.8 -1 Veloc./ml.) 0 -0.5) REPRESENTACIÓN LINEAL DIRECTA Tabla N°11: Valores de la cantidad de sustrato y velocidad PAPAYA [S]inicial (mg.5 4 Figura N°06: Representación lineal directa -De la figura N°06. se obtienen los valores de Km y Vmáx de la siguiente manera: Km 0.45 0.0924 .2 0.16 0.12 0.072 0.6 -0.06 0.0924 Promedio Km=1.7 2 3.5 3 3.056 0.02 0 -1 -0.29 Vmax=0.29 Vmax 0.1 V 0.12 0.166 0.048 0.08 0.15 1.0402 0. (mg.0333 0./min) 0 0.0201 0.2 -0.14 0.

71392875 0.10649019 R2 0.36 14.82485876 0.0029985 6.9838 0. 1998).4137 - 3.0416 0. (Doran. Esta metodología hace uso de métodos espectrofotométricos de gran rapidez. 2004) -En los métodos utilizados podemos notar como el Km va tomando valores relativamente bajos dependiendo del método de linealizacion realizado. lo que indica la mayor eficacia de esta representación frente a las otras dos. (Izquierdo. La representación lineal es un método relativamente insensible a las lecturas erróneas individuales que se encuentran lejos de los valores correctos. 2002) -Un inconveniente de la representación Lineal directa podría dar la dificultad de detectar las desviaciones del comportamiento de michaelis menten. por su sustrato de almidón. Este método se recomienda para aquellas enzimas que se conoce que obedecen a una cinética de michaelis menten. (Doran.39629558 6.98359688 Km 0.1235 0. se vio solo la mitad de la velocidad máxima de la enzima.Tabla N°12: Cuadro comparativo de los resultados finales REPRESENTACIÓN MICHAELIS MENTEN LINEWEAVER BURK EADIE HOFSTEE LANGMUIR LINEAL DIRECTA Vmáx 0. DISCUSIONES -La cinética de las enzimas se estudia usualmente observando las velocidades de reacción para evitar así los problemas relacionados con la inhibición por producto y con cualquier cambio de pH que pueda haber como resultado de la reacción.66666667 3. -Los valores de los parámetros biotecnicos obtenidos mediante la representación de langmuir son los más próximos a los de la regresión lineal.354 2.9919 0. 1998) . Ya que a una baja concentración de almidón. esto demuestra la alta afinidad de la enzima extraída de la papaya. (Atkinson.

Eadie Hofstee. Worth Publishers. REACTORES BIOQUIMICOS.-En el laboratorio trabajamos con un sustrato la cual a una velocidad máxima no puede ser medido con exactitud. . Langmuir y Lineal Directa 5.M.Ediciones de la universidad de Barcelona. -Nelson. -Izquierdo Felipe y col. Lehninger Principles of Biochemistry. lo que indica que existe una unión muy fuerte del complejo enzima-sustrato (ES) por el sustrato. P. Para nuestro caso el valor de Km fue bajo (0.). PROBLEMAS RESUELTOS DE CINETICA DE LAS REACCIONES QUIMICAS. D. a pesar de ello nos sirvió de parámetro la concentración de sustrato conocida como constante de Michaelis-Menten (Km) a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima. Editorial reverte. M. 2000) -Valores bajos de la constante Michaelis-Menten (Km) indican que el complejo ES está unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto.(3 Ed.. (Nelson. BIBLIOGRAFÍA -Atkinson B.. (2000). CONCLUSIONES -Se trabajó con los respectivos parámetros que determinan la velocidad enzimática aplicando graficas tales como las de cinética enzimática de Michaelis Menten (Vmax y Km) y se las pudo comparar con los obtenidos por las representaciones Lineweaver – Burk. 2004. 2002. 1998. Cox. 2000) 4. “Principios de Ingeniería de los bioprocesos”.DORAN. Editorial acribia SA. Zaragoza (España).L. New York ..36). (Nelson.

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