UNIVERSIDAD NACIONAL

AGRARIA LA MOLINA
FACULTAD DE CIENCIAS
ENZIMOLOGÍA
REPORTE DE PRÁCTICAS

TEMA: DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE FOSFATASA ÁCIDA

DIA 1: DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS EN
EL EXTRACTO CRUDO DE HÍGADO (BIURET)

RXN. DE BIURET
CON PROTEÍNAS
MECANISMO DE LA
REACCIÓN DE BIURET

PROFESORA:
ANA KITAZONO SUGAHARA

INTEGRANTES:
-CHRISTIAN EGUIZÁBAL (INTRODUCCIÓN) 100%
-RENZO RODRÍGUEZ (CONCLUSIONES, DISCUSIONES) 100%
-ANGEL ROJAS (MATERIALES Y MÉTODOS) 100%
-ROBERTO ROJAS (CALCULOS Y RESULTADOS,) 100%

LIMA – PERU
2016
 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE FOSFATASA ÁCIDA

DÍA 1: DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS EN EL

EXTRACTO CRUDO DE HÍGADO (BIURET)

1. INTRODUCCIÓN
Las fosfatasas ácidas se encuentran presentes en casi todos los tejidos del organismo, siendo
particularmente altas las cantidades de estas enzimas en próstata, estómago, hígado, músculo,
bazo, eritrocitos y plaquetas. Las distintas isoenzimas se diferencian entre sí por su pH óptimo,
peso molecular, y requerimientos de activadores e inhibidores. La fosfatasa ácida prostática
(PAP) constituye un valioso auxiliar en el diagnóstico precoz de cáncer prostático, una de las
formas neoplásicas de mayor morbilidad. La determinación de la actividad enzimática de PAP
usando α-naftil fosfato como sustrato ha mostrado sensibilidad y especificidad adecuadas para
su utilización en el diagnóstico de esta enfermedad.
Se encuentran actividades elevadas de Fosfatasa ácida total (ACP) en algunas enfermedades
hematológicas (leucemia mielocítica, trombocitopenia idiopática) y óseas (enfermedad de
Paget, carcinoma óseo), así como en algunos tipos de cáncer, enfermedades hepáticas (hepatitis,
ictericia obstructiva), etc.

En esta oportunidad evaluaremos el accionar de la fosfatasa ácida proveniente del hígado de

“Bonito”, para esto se preparó un extracto del crudo de este órgano fresco, es importante
verificar que el material utilizado sea fresco y se conserve congelado para evitar contaminación,
putrefacción y accionar de otras enzimas hidrolíticas que pudiesen variar el resultado del
experimento. La solución en la que se extraiga la enzima debe estar constituida con un buffer,
acetato en este caso, para así poder mantener las condiciones de pH ideales para el accionar de
la enzima.

El conocimiento de la cinética de las reacciones enzimáticas ayuda a comprender los fenómenos

biológicos y a precisar las condiciones adecuadas de actividad enzimática para definir sus
unidades y establecer comparaciones.

2. MATERIALES Y MÉTODOS
Equipos y materiales
· Homogeneizador · Pipetas
· Espectrofotómetro · Tubos de ensayo
· Vórtex · Gradillas
· Baño María (37°C) · Hígado de pescado (Bonito)

Reactivos
· NaOH 6M
· Buffer acetato
· Reactivo de Biuret: se disuelve 3 g de sulfato de cobre en 500 mL de agua destilada,
luego se agrega 9 g de tartrato de sodio y potasio KOOC(CHOH)2 COONa.4H2O y 5 g de
yoduro de potasio. Finalmente se agrega 100 ml de NaOH 6M y se diluye a 1L de agua
destilada. Se almacena en botella de plástico a temperatura ambiente (estable por 6 meses).
· Solución estándar de proteína albúmina (5mg/mL): De una fiola de 10mg/mL
sacamos 1mL de la solución en un tubo hasta tener diluirla con 1 mL de agua para llegar a
tener una concentración de 5mg/mL.
 Procedimiento:
Tabla 1: Esquema experimental de la tabla del ensayo

B1 E1 E2 E3 E4 E5 M RM

H2 O destilada 0.5 mL 0.4 mL 0.3 mL 0.2 mL 0.1 mL - 0.4 mL 0.4 mL

Albúmina - 0.1 mL 0.2 mL 0.3mL 0.4 mL 0.5 mL - -

Sobrenadante - - - - - - 0.1 mL 0.1 mL

Reactivo de 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL 2.5 mL

Biurtet

Incubar a 37°C por 10 min y enfriar a T° ambiente

Leer a 540 nm en el espectrofotómetro

Fundamento:
Luego de haber pesado 6 g de hígado de pescado, se agrega 24 mL de buffer acetato y
homogenizar para liberar la enzima. Tras haber obtenido un preparado homogéneo, centrifugar
por 15 min a 6000g por 4°C, en las cuales se obtendrá un sobrenadante y un precipitado en un
tubo de eppendorf. A continuación, para calcular la concentración de proteínas totales, se va a
calibrar la curva de la muestra de extracto de hígado con una muestra conocida de albúmina de
bovino, a partir de ello podremos estimar la concentración de proteínas totales en el extracto.

3. CÁLCULOS Y RESULTADOS
a) Resultados de las absorbancias netas:

M1 M2 M3 M4 M5 M6

E1 0.019 0.02 0.019 0.022 0.041 0.024

E2 0.04 0.039 0.043 0.042 0.063 0.039

E3 0.059 0.057 0.066 0.063 0.075 0.057

E4 0.079 0.075 0.087 0.083 0.091 0.077

E5 0.098 0.097 0.107 0.102 0.106 0.096

M 0.25 0.245 0.241 0.247 0.627 0.24

RM 0.253 0.257 0.252 0.254 0.639 0.249

*M5 presenta discrepancias probablemente debidas a errores en las mediciones

b) Hallamos las concentraciones de proteína en cada tubo: Nuestra solución estándar de

proteína fue de 5mg/mL y se agregó distintas cantidades a cada tubo, a continuación los cálculos
para determinar la concentración.
(E1)
5mg -----------> 1mL X= 0.5 mg ---------> 3 mL
X -----------> 0.1mL 16.67mg --------> 100 mL …. (16.67mg%)

(E2)
5mg -----------> 1mL X= 1 mg ---------> 3 mL
X -----------> 0.2mL 33.33 mg --------> 100 mL …. (33.33mg%)

(E3)
5mg -----------> 1mL X= 1.5 mg ---------> 3 mL
X -----------> 0.3mL 50 mg --------> 100 mL …. (50 mg%)

(E4)
5mg -----------> 1mL X= 2 mg ---------> 3 mL
X -----------> 0.4mL 66.67mg --------> 100 mL …. (66.67 mg%)

(E5)
5mg -----------> 1mL X= 2.5mg ---------> 3 mL
X -----------> 0.5mL 83.33 mg --------> 100 mL …. (83.33 mg%)

c) Elaboramos la curva de calibración:

● Mesa N°1

Absorbancia [ ] mg%

E1 0.019 16.67
ABSORBANCIA

E2 0.04 33.33

E3 0.059 50

E4 0.079 66.67

E5 0.098 83.33

CONCENTRACIÓN (mg%)

● Mesa N°2
 Absorbancia [ ] mg%

ABSORBANCIA
E1 0.02 16.67

E2 0.039 33.33

E3 0.057 50

E4 0.075 66.67

E5 0.097 83.33

CONCENTRACIÓN (mg%)
● Mesa N°3
●
Absorbancia [ ] mg%

E1 0.019 16.67
ABSORBANCIA

E2 0.043 33.33

E3 0.066 50

E4 0.087 66.67

E5 0.107 83.33

CONCENTRACIÓN (mg%)

● Mesa N°4

Absorbancia [ ] mg%

E1 0.022 16.67
ABSORBANCIA

E2 0.042 33.33

E3 0.063 50

E4 0.083 66.67

E5 0.102 83.33

CONCENTRACIÓN (mg%)

● Mesa N°6
 Absorbancia [ ] mg%

E1 0.024 16.67

ABSORBANCIA
E2 0.039 33.33

E3 0.057 50

E4 0.077 66.67

E5 0.096 83.33

CONCENTRACIÓN (mg%)

d) Utilizando la ecuación de la recta determinamos la concentración de proteínas en el tubo

muestra y posteriormente en el extracto crudo:

● Mesa N°1
(Promedio de absorbancia de la muestra = 0.2515)

A= 0.0012C-0.0001 ---------> 0.2515 = 0.0012C - 0.0001 ------> C = 209.67 mg%

C = 209.67 mg ----------> 100 mL

6.29 mg ----------> 3 mL (tubo de ensayo)

6.29 mg ----------> 0.1 mL (sobrenadante)

62.9 mg ---------> 1 mL …(62.9mg/mL de proteínas en el sobrenadante)

● Mesa N°2
(Promedio de absorbancia de la muestra = 0.251)

A= 0.0011C-0.0006 ---------> 0.251 = 0.0011C - 0.0006 ------> C = 228.73 mg%

C = 228.73 mg ----------> 100 mL
6.86 mg ----------> 3 mL (tubo de ensayo)

6.86 mg ----------> 0.1 mL (sobrenadante)

68.60 mg ---------> 1 mL … (68.6mg/mL de proteínas en el sobrenadante)

● Mesa N°3
(Promedio de absorbancia de la muestra = 0.2465)
 A= 0.0013C-0.0016 ---------> 0.2465 = 0.0013C - 0.0016 ------> C = 190.85 mg%
C = 190.85 mg ----------> 100 mL
5.73 mg ----------> 3 mL (tubo de ensayo)

5.73 mg ----------> 0.1 mL (sobrenadante)

57.30 mg ---------> 1 mL … (57.3 mg/mL de proteínas en el sobrenadante)

● Mesa N°4
(Promedio de absorbancia de la muestra = 0.2505)

A= 0.0012C-0.0021 ---------> 0.2505 = 0.0012C - 0.0021 ------> C = 210.5 mg%

C = 210.5 mg ----------> 100 mL
6.32 mg ----------> 3 mL (tubo de ensayo)

6.32 mg ----------> 0.1 mL (sobrenadante)

63.20 mg ---------> 1 mL … (63.2mg/mL de proteínas en el sobrenadante)

● Mesa N°6
(Promedio de absorbancia de la muestra = 0.2445)

A= 0.0011C-0.004 ---------> 0.2445 = 0.0011C - 0.004 ------> C = 225.91 mg%

C = 225.91mg ----------> 100 mL
6.78 mg ----------> 3 mL (tubo de ensayo)

6.78 mg ----------> 0.1 mL (sobrenadante)

67.80 mg ---------> 1 mL … (67.8mg/mL de proteínas en el sobrenadante)

Al final, promediando todos los valores de proteínas

M1 M2 M3 M4 M6 PROM
62.9 68.6 57.3 63.2 67.8 63.96 mg/mL

Podríamos terminar calculando la concentración de proteínas presentes en los 6 gramos del

hígado del “bonito”, pero nos falta saber el dato del volumen del sobrenadante.

4. DISCUSIONES
Hay varios métodos de determinación de la cantidad de proteínas presentes en cierta matriz a
analizar, por ejemplo tenemos al ensayo de Kjeldahl, el análisis de actividad enzimática, etc.
Sin embargo, el método más sencillo y uno de los más exactos, si bien no es específico de una
proteína, es el método de Biuret. Este método usado en la práctica realizada consiste en la
formación de un complejo coloreado entre el Cu+2 y los grupos NH de los enlaces peptídicos en
medio básico, de manera que la intensidad de coloración es directamente a la cantidad de
proteínas al detectar estos enlaces (Fernández & Galván, s.f.)

Una herramienta de gran utilidad a la hora de hallar la concentración de proteínas mediante los
métodos espectrofotométricos es la contrucción de una curva de calibración. Se hace uso de una
 batería de soluciones estándar (cuya concentración es conocida), a las cuales después de aplicar
el ensayo de Biuret, se puede hallar la absorbancia y con los datos de concentración vs.
Absorbancias realizar una curva de calibración. Todas las mesas, salvo una por un error
experimental, lograron tener resultados uniformes respecto a las absorbancias, y todas las
gráficas tienen aproximadamente un 98% de explicación por los datos. De esta manera podemos
sacar una ecuación rectilínea, que vendría ser un modelo aproximado de la ley de Lambert-
Beer, incluso podemos darnos cuenta que la pendiente es el coeficiente de absortividad
(considerando que las unidades de concentración están expresados en mg%)

Si hubiéramos llegado a saber el volumen del sobrenadante, podríamos llegar a hallar los
miligramos de proteína presentes por gramo de hígado. Las concentraciones normales de
proteína en el hígado de pescado como el “bonito”, al menos en el “bonito ojón” o “hojita” u
“orqueta” (Chloroscombrus orqueta) es de 0,192003 mg/g promedio según Saa et al (2012). El
porcentaje total de proteínas, como dato extra, en el músculo de este pescado puede llegar a
tener niveles altos de 21 g/100g (g%) de pescado (Fundación EROSKI, s.f.)

5. CONCLUSIONES
El ensayo de Biuret es uno de los métodos más utilizados en la detección de proteínas, pero no
es específico de un tipo en particular. La concentración de proteínas en el sobrenadante
calculado fue de 63.96 mg/mL en promedio.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Fernández E & Galván A. s.f. “Métodos para la cuantificación de proteínas”
Universidad de Córdoba. Córdoba, España.
2. Fundación Eroski, “Pescados y mariscos: guía práctica sobre pescados: Bonito”
http://pescadosymariscos.consumer.es/bonito/introduccion (Último acceso el 13 de octubre del
2016, 12:05 pm)
3. Saá J, Suárez A, Viteri E. 2012. “Comparación del nivel proteico del hígado en 4
especies de peces comestibles de la provincia de Santa Elena durante Noviembre 2011-Febrero
2012”. Universidad Estatal Península de Santa Elena. Santa Elena, Ecuador