PREINFORME

PRACTICA N. 4
EXTRACCIÓN DE LA CASEÍNA, DETERMINACIÓN DEL
PUNTO ISOELÉCTRICO Y PRECIPITACIÓN SALINA DE
PROTEÍNAS

Nallely Julianny Jaimes Sanabria

Marco teórico

Kappa caseína de la lecha es una proteína, la cual está asociada al calcio en

forma de fosfato de calcio
O
C S
IA
R
EXTRACCIÓN DE LA CASEÍNA,

TÍN
, CE La kappa caseína se considera una fosforo tenia
A
NL ÉT Í
O
EER
Y PRECIPITACIÓN SALINA DE

O
S P
DETERMINACIÓN DEL PUNTO

AISE
C A La kappa caseína tiene pocos grupos fosfato y un alto contenido de carbohidratos unidos a ella
EU OD
L I
DP
NL ESA
Ó
I DN
C Ó
La caseína esta presente en la leche como sal de calcio y caseinato de calcio
CNIC
AIÓ
ISOELÉCTRICO

RCA T Punto isoeléctrico como el ph en el cual una proteína tiene cargas

T
X AP
II
netas cero
EN IC
ME
RR
EP
TY Puede presentar grupos con cargas positivas y negativas y la suma de las
E
D mismas debe ser cero

Procedimiento
 Caliente en un vaso de precipitado 150 ml de agua
destilada a 38ºC, Añada 50ml de leche y luego gota a
gota, con agitación, adicione ácido acético 1M hasta
que observe que se forma un precipitado (la leche se
corta).
Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un
. embudo. Guarde el filtrado para realizar la Parte IV de
Procedimiento.

o
t esta práctica.
Parte 1

n e Extracción de
1
im t la caseína Lave el precipitado con 20ml de etanol en el mismo
i re filtro.
d a
P
e
c
o
r Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel
de filtro

Coloque el precipitado en un vaso de precipitado

pequeño previamente pesado, vuelva a pesar el vaso
con el precipitado y luego adicione 5ml/g de éter etílico.

Deseche el líquido quedando un precipitado blanco de

fácil manipulación que es la caseína.

Coloque aproximadamente 250 mg de caseína en un

vaso de 50ml.
.
Procedimiento.

o
t
Parte 2

n
m et Preparación de Una vez disuelta la caseína, se vierte en un matraz
2
ir la solución de aforado de 50 ml, adicione 5 ml de ácido acético 1N y
d a
e P caseína diluya con agua destilada hasta 50ml y mezcle bien.
c
o
r
La solución debe ser clara y limpia y si no es así, debe
volver a filtrar.
 En diez vasos de 25 ml, limpios y secos
adicione exactamente los volúmenes de los
reactivos según la tabla

Medir experimentalmente el pH de todos

los vasos, que debe cubrir un rango
aproximado semejante al teórico (3 a
.
6,5). Anotar los valores reales en la
Procedimiento.

o
t
n Tabla, que deben ser semejantes a los
Determinació
Parte 3

e
ii t 3 expresados y en todo caso crecientes.
n del punto
d er a
m Isoeléctrico
e P Añadir 1 ml de disolución de caseína
c
o de la caseína. preparada en la parte II a cada tubo
rP

Agitar suavemente cada uno de los tubos y

esperar aproximadamente 3 minutos.

Medir la absorbancia de cada muestra a 640

nm.

Anotar los resultados, y graficar la

absorbancia frente al pH, y determinar la pI.

TABLA 1. De Disoluciones añadir 1 ml de disolución de caseína a cada tubo.

TUB Acetato Acético Acético pH

O 0.1N 0.1N 0.01 N resultante
(aprox.)
1 0.5 9.5 3.2
2 1 9 3.6
3 1.5 8.5 3.8
4 2 8 4.0
5 3 7 4.2
6 4 6 4.5
7 6 4 4.7
8 8 2 5.1
9 6 - 4 5.5
10 8 - 2 6.1
 Prepare 10mL de una solución
saturada de sulfato de
amonio.

Tome dos tubos de ensayo adicione a

. cada uno 1,5 mL de la solución de
Procedimiento.

o
t sulfato de amonio saturada
n
Parte 4

e 4 Precipitació
i
ir t n salina de
da Proteínas. A uno de los tubos adicione 1,5 mL del
e
c P filtrado que guardo en la parte I de esta
o
práctica. Al otro tubo adicione un 1,5mL de
la solución de caseína preparada en la parte
II.

Centrifugue y observe si se forma un pellet.

 PREINFORME
PRACTICA N. 5
CUANTIFICACION DE PROTEINAS

Nallely Julianny Jaimes Sanabria

Marco teórico

S
A Hay diferentes
N
I métodos para la
E cuantificación Método de Bradford: está basado en el
T
O de proteínas cambio de color del colorante azul
R
P brillante de Coomassie en respuesta a
CUANTIFICACION DE

E diferentes concentraciones de proteína

D Entre los métodos
N que se basan en la
O formación de Lowry: es un ensayo bioquímico para la
I determinación del nivel total de proteínas
C complejos
A en una disolución.
PROTEINAS

colorimétricos entre
C
I las proteínas y
F reactivos Biuret: es la técnica más simple para la
I
T específicos se determinación de las proteínas
N solubles.
A encuentran
U Las sustancias que poseen 2 o más
enlaces peptídicos forman un
complejo coloreado purpura con sales
de cobre alcalinas.

Tubo Solución * Absorban Proteína

No. cia (mg)
1 3 ml NaCl al 0.9%, Blanco
2 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl
3 0.2 ml BSA y 2.8 ml NaCl
4 0.4 ml BSA y 2.6 ml NaCl
5 0.8 ml BSA y 2.2 ml NaCl
6 1 ml BSA y 2 ml NaCl
7 0.25 ml caseína y 2.75 ml
NaCl
8 0.5 ml caseína y 2.5 ml NaCl
9 0.25 ml sobrenadante y 2.75
ml NaCl
10 0.5 ml sobrenadante y 2.5 ml
NaCl
11 0.25 ml leche diluida y 2.75
ml NaCl
12 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml
 NaCl

Procedimiento
Pesar 0.1 g de caseína y colocarla en un vaso de precipitado de
100 mL. Añadir 30 mL de solución de NaCl al 1%, agregar
gota a gota una disolución concentrada de NaOH 1N hasta
completar la disolución de la proteína.
Pasar la disolución anterior a un matraz aforado de 50 mL y
aforar. Esta es la disolución problema y de estas se tomarán
alícuotas.

Para la preparación de la muestra problema de leche; tomar 0.1

mL de leche y realizar una dilución de 1:10 (Vol. Final: 1 mL).
Si la concentración de proteína no se encuentra dentro del
C UA N T IF IC A C IO ND E P R O T E

rango de absorbancia preparar diluciones de 1:20, 1:100 y

1:1000 de la solución inicial

N
I Separar los tubos de ensayo en dos grupos, los seis primeros
E se utilizaron para obtener la curva patrón y los otros seis para
T analizar la muestra problema, el tubo 1 contendrá el blanco, del
O tubo 2 al 6 adicionar los siguientes volúmenes: 0.1ml, 0.2ml,
R
P 0.4ml, 0.8ml y 1.0ml de solución de albumina sérica bovina
E (BSA), respectivamente
D
N los tubos 7 a 12 se tratará con la muestra problema y el
O reactivos de Bradford con la misma cantidad (3 mL), como se
muestra en la tabla 1, se homogeniza la solución por medio
IN A S

de un agitador tipo vortex. (Solamente al tubo 1 se le

agregaron 3 ml de reactivo de Bradford y 3 ml de NaCl).

Llevar los tubos aa 11000 “cc durante 1100 minutos hasta la

formación del complejo. dejar reposar las soluciones hasta
alcanzar la temperatura ambiente. (realizar un ensayo con sin
calentamiento
realizar la cuantificación de la solución por medio de un
espectrofotómetro a 595 nm para el reactivo de Bradford,
entre cada medición lavar las celdas; al tener todas las
mediciones realizar la curva de calibración.

Realice y grafique la regresión lineal a partir de los datos de

la curva de calibración realizada con la albumina de suero
bovino y halle las concentraciones de las muestras problema.
 PREINFORME
PRACTICA N. 6
HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

Nallely Julianny Jaimes Sanabria

Marco teórico

Un catalizador es una sustancia que aumenta la velocidad de una reacción química, sin
sufrir ningún cambio al final de la misma.
N
HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN

Ó
D
I La sustancia sobre la que actúa una enzima se llama sustrato.
M
L
A Las enzimas son proteínas de peso molecular elevado. Su estructura tridimensional está
L determinada por la secuencia de aminoácidos que caracteriza a cada una.
E
D La actividad enzimática puede verse afectada por cualquier factor físico o químico que
S altere su estructura tridimensional.
I
S
I
L
Ó De acuerdo con las reacciones que catalizan, las enzimas se clasifican en 6 clases:
R
D
I
Oxidoreductasas, tranferasas, hidrolasas, liasas, isomerasas, ligasas

Procedimiento
 Coloque 10 mL de una solución de almidón al 1% en un tubo
de ensayo grande.

Añadir 1 mL de HCl concentrado al tubo. Agitar bien y

luego colocar el tubo en un baño de agua hirviendo durante
2h con cuidado de no quemarse.

. Realice la prueba de yodo, desde el tiempo cero y

sucesivamente cada 15 minutos durante las dos horas del
Procedimiento

o 1t
PARTE 1

n hidrolisis de
e
i E almidón en tiempo de incubación. Para esto en un tubo de ensayo
T
im R medio ácido adicione 5mL de agua destilada, 2 gota de solución de yodo
d A y 0,5 ml dela solución de yodo que se está hidrolizando en el
e P
c baño maría a ebullición, registre el resultado de la prueba en
o
r
P cada tiempo de evaluación.
.

Una vez transcurrida las dos horas o cuando obtenga una

prueba de yodo negativa, efectúe la prueba de Benedict.
Tome o,5mL de la solución de almidón hidrolizado , 1ml de
NaOH 0,4M (para neutralizar el ácido) y 2,5 mL de
reactivo de Benedict. Incubar por 8 minutos en agua
hirviendo.
Anotar y analizar los resultados.
 Tome cuatro tubos de ensayo y márquelos del 1 al 4. Y a los
tubos 1 a 3 agregue 2mL de solución de almidón al 1%

Al tubo 1 adicione 1mL de saliva y llévelo a baño maría a 37°

durante 5 minutos.

. Al tubo 2 agregue dos gotas de lugol, observe y reporte el

Procedim iento.

o
t
resultado.
n
Al tubo 3 adicione 2mL de reactivo de Benedict y póngalo a baño
parte 2

e
2 i hidrolisis maría en ebullición. Agite suavemente y observe los cambios que
enzimática del
dr almidón
se presentan.
e a
cp
o
r
Pase la mitad del contenido del tubo . 1 al tubo
4. Al tubo Nº. 1 agréguele 2 gotas de lugol. Observe y explique el
resultado

Al tubo 4 agréguele 2 ml de reactivo de Benedict y póngalo

en el baño de María en ebullición. Observe y explique el
resultado.
 PREINFORME
PRACTICA N. 7
EFECTOS DE LA TEMPERATURA Y EL PH SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Nallely Julianny Jaimes Sanabria

Marco teórico
Las enzimas poseen grupos químicos ionizables en las cadenas laterales de sus
LCA aminoácidos.
EFECTOS DE LA TEMPERATURA Y EL

EI
YÁT El pH óptimo de una enzima puede guardar relación con cierta carga eléctrica de la
AIM superficie, o con condiciones óptimas para la fijación de la enzima a su sustrato.
RZ
U
TN Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva, negativa o
AE neutra.
R
PH SOBRE LA ACTIVIDAD

EAD
PD
M I
EV
TTI
AC La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH.
LA
EA
ENZIMÁTICA

DL
SE La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama temperatura
OR óptima.
TB
CO
ES
FH
E los aumentos de temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC de
P incremento, la velocidad de reacción se duplica.
 Prepare una solución de amilasa salival
diluida, para esto tome 1mL de saliva y
adicione 9mL de agua destilada, agite
cuidadosamente hasta formar una
solución homogénea.
Tubo 1: 2mL de HCl 0,1N +
2mL de solución de almidón
al 2%

Tubo 2: 2mL de NaOH 0,1N +

Tome tres tubos de ensayo y adicione: 2mL de solución de almidón al
PPrroocceeddiimmii

2%
Adicione 2mL de solución de amilasa
salival diluida a cada tubo de ensayo.
Efecto
del pH Agite bien y mida rápidamente el pH de
cada tubo , para esto utilice cinta Tubo 3: 2mLde agua destilada +
sobre la 2mL de solución de almidón al
activida indicadora de pH, compare el color
obtenido con el de la escala. 2%
d
eennttoo..

amilasa
salival. Coloque los tres tubos en baño de maría a
37°C durante 15 minutos.
Transcurridos los 15 minutos, por cada
una de las tres condiciones evaluadas
(HCL 0,1N, NaOH 0,1N y Agua
destilada) tome dos tubos de ensayo y
transfiera 1mL de la solución.

En un tubo, realice el ensayo de yodo,

por adición de 2 gotas de Lugol y en el
otro adicione 2mL de reactivo de
Benedict y lleve a baño maría a
ebullición

Parte II. Influencia de la temperatura en la velocidad enzimática

1. Prepare 8 tubos: cuatro de ellos con 2ml de almidón 2% y los otros cuatro
con 2 ml de saliva diluida.
2. Colocar durante 15 minutos dos tubos, uno conteniendo almidón y el otro
saliva, a cada una de las cuatro temperaturas siguientes (marque cada
pareja de tubos según la temperatura a la que se ensaya).
i. Baño de hielo (0OºC, ponga hielo en un vaso de precipitado y añada
un poco de agua, si dispone de nevera coloque todo el montaje a 4°
para garantizar la temperatura durante el ensayo)
ii. Temperatura ambiente (20ºC)
 iii. Baño maría a 37ºC B
iv. Baño maría a ebullición (100ºC).
3. Añadir al tubo que contiene el almidón el contenido del tubo que tiene la
saliva, agitar bien y dejar que siga a su temperatura correspondiente
4. Empiece a contar el tiempo (los tubos deben mantenerse bien inmersos en
los respectivos baños para que la acción de la amilasa tenga lugar a las
temperaturas indicadas).Transcurridos 1, 2, 3, 4,
6 y 8 minutos tomar una muestra de 0,5 ml de cada tubo y transferirlo a
un tubo de ensayo y realizar la prueba de yodo.
5. Analice los cambios de coloración y realice las comparaciones entre las
cuatro condiciones de temperatura evaluadas.
 Pre_informes

Estudiantes:
Nallely Julianny Jaimes Sanabria

Tutor:
Mónica Andrea Vinchira Lamprea

Curso: Bioquimica

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

Programa de Tecnología en Regencia de farmacia
Mayo 2022