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PROTENAS II PARTE

I.

OBJETIVOS:

Preparar casena.
Realizar pruebas caractersticas de la casena.
Realizar pruebas con protenas coagulables.

II. PRINCIPIOS TERICOS:


La casena es una fosfoprotena (un tipo de heteroprotena) presente en la leche y en algunos de
sus derivados (productos fermentados como el yogur o el queso). En la leche, se encuentra en la
fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en un complejo que se ha denominado
caseingeno.
Las casenas es un conjunto heterogneo de protenas por lo que es difcil fijar una definicin.
Sin embargo, todas las protenas englobadas en lo que se denomina casena tienen una
caracterstica comn: precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4,6. Por ello, a la casena
tambin se le suele denominar protena insoluble de la leche. Por otra parte, y aunque las
protenas que se denominan casenas son especficas de cada especie, se clasifican en los
siguientes grandes grupos de acuerdo con su movilidad electrofortica: s1-casena, s2-casena,
-casena y -casena.
Propiedades qumicas y fsicas de las casenas
A diferencia de muchas otras protenas, incluso del queso, las casenas no precipitan por accin
del calor. Por el contrario, precipita por la accin de una enzima proteasa presente en el
estmago de los mamferos llamada renina y forma un precipitado denominado paracasena. Si
la precipitacin se realiza por la accin de cidos, se le llama casena cida. En la elaboracin de
los quesos tienen lugar ambos tipos de precipitaciones.
La secuencia aminoacdica de la casena contiene un nmero inusual de residuos del aminocido
prolina: entre 10 en la -casena y 35 en la -casena. Como resultado, las casenas son
relativamente hidrofbicas (poco soluble en agua) y carecen de estructura secundaria o terciaria
bien definidas. En la leche se encuentra como suspensin de partculas que asemeja a las micelas
de surfactantes (pequeas esferas hidroflicas en el exterior e hidrfobicas en el interior). Estas
micelas de casena se estabilizan por iones de calcio e interacciones hidrofbicas.

III. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS:


III.1.

Materiales:

Tubos de ensayo
Vasos de precipitado de 50 ml
Una gradilla para tubos de ensayo
Un erlenmeyer de 250 ml
Un erlenmeyer de 150 ml
Probeta de 50 ml
Dos pipetas graduadas de 5.0 ml

Dos pipetas graduadas de 1.0 ml


Agitador de vidrio
Embudo de vidrio mediano
Vidrio de reloj
Papel filtro
Dos goteros de plstico
Pinzas para tubos de ensayo

HNO3 (c)
Hidrxido de calcio
Reactivo de Biuret
Reactivo de Fehling A
Reactivo de Fehling B

3.2 Reactivos:

Agua destilada
cido actico
Carbonato de calcio
HCl al 2%
NaOH al 1%
NaCl al 10%


3.3 EQUIPOS:
Mquina de centrifugacin

IV. PARTE EXPERIMENTAL:

1.
AISLAMIENTO DE LA CASENA:

a) En un vaso de precipitados de 250 ml se colocaron 100 ml de leche pura de vaca, a la


cual, previamente, se elimin la mayor cantidad de grasa posible, mediante
centrifugacin durante 5 minutos a 3000 rpm. A continuacin, se midi el pH de la
leche y por medio de la acidificacin con HCl al 20% se llevo el pH de la misma hasta
4.0.
b) Posteriormente se dej reposar alrededor de 15 minutos aproximadamente hasta
observar grumos en la superficie. Inmediatamente despus, el precipitado se reparti en
cuatro tubos de centrifuga; se centrifug durante 10 minutos a 2000 rpm.
c) Al trmino de la centrifugacin se retiraron los tubos y se separ en un tubo de ensayo el
lquido de la superficie y se guard. Posteriormente, la leche descremada se puso en un
vaso de precipitado y se homogenizo con 20 ml de agua destilada, la solucin se coloc
en un solo tubo de centrifuga y en otro tubo agua para equilibrar con un mismo peso, se
dejo 10 minutos a 2000 rpm, con el objeto de eliminar el HCl.
d) Posteriormente, se elimin el sobrenadante y a la fase slida (leche descremada) se
agregaron 10 ml de etanol, se homogeniz con una varilla de vidrio y al terminar se
centrifug a 10 minutos a 2000rpm.

e) De la misma manera, se elimin el sobrenadante y a la fase slida se le agregaron 5 ml


de acido actico y 5ml de ter, se homogeniz, al terminar se coloc en la centrifuga a
10 min a 2000 rpm. Por ltimo se elimin el sobrenadante y el precipitado se guard
hasta que se secara; se peso el precipitado seco.
f) Observamos el aspecto de la casena, pesar y calcular el porcentaje de casena en la leche
experimentada.

AADIMOS HCl
HASTA QUE TENGA
UN pH DE 4.0

SE SEPARA EL
LIQUIDO DE LA
SUPERFICIE Y SE
SE ELIMINA
EL
15 SOBRENADA

min
LECHE
PURA DE
VACA

CENTRIFUGAMO
S POR 5 Min A
3000 rpm

CENTRIFUGAMO
S POR 10 Min A
2000 rpm
SE ELIMINA
EL
SOBRENADA

LECHE
SE
DESCREMAD PASA A
A CON 20ml
UN
DE AGUA
TUBO
DESTILADA
DE

EQUILIBR
A-MOS
CON AGUA
CON EL
MISMO
PESO EN
UN TUBO

SE ELIMINA
EL
EL
PRECIPITAD
SOBRENADA
O SE
GUARD
HASTA QUE

CENTRIFUGAMO
S POR 10 Min A
2000 rpm

FASE
CENTRIFUGA
SLIDA + MOS POR 10
10 ml de Min A 2000
rpm

FASE SLIDA +
5 ml de CIDO
ACTICO + 5
ml DE TER

CENTRIFUGA
MOS POR 10
Min A 2000
rpm

2. PROPIEDADES Y PRUEBAS CARACTERISTICAS DE LA CASENA

2.1. Composicin elemental: presencia de C, H, O y N

En un tubo de ensayo pequeo limpio y seco pusimos 0.5 g de casena en polvo y


cogiendo con una pinza lo calentamos directamente con la llama suave del mechero.
Observamos y tomamos nota del cambio de color de la casena.

CASEN
A EN
POLVO

HUMOS
BLANQUECI
NOS
GOTAS
DE
AGUA

RESIDU
OS DE
COLOR
NEGRO

2.2. Solubilidad
1. Marcamos 5 tunos de ensayo como: A, B, C, D y E. Pusimos a cada tubo una
pequea porcin de casena.
2. Agregamos a los tubos 5 ml de: al tubo A, agua destilada, al B, cloruro de sodio al
10%, al C, solucin de HCl al 0.2%, al D, solucin de NaOH al 1% y al E, solucin
saturada de hidrxido de calcio. Agitamos los tubos y anotamos las observaciones
relativas a la solubilidad de la casena.

CASEN
A EN
POLVO

5 ml de
AGUA
DESTILA
DA

INSOLUB
LE

CASEN
A EN
POLVO

5 ml de
CLORUR
O DE
SODIO
AL 10%

INSOLUB
LE

CASEN
A EN
POLVO

5 ml de
CIDO
CLORHIDRI
CO AL

INSOLUB
LE

CASEN
A EN
POLVO

CASEN
A EN
N POLVO

ES:

5 ml de
HIDRXID
O DE
SODIO AL
1%

SOLUBLE

5 ml de
HIDRXI
DO DE
CALCIO

INSOLUB
LE

2.3. Prueba del Biuret:


CASEN

De acuerdo a la prueba de solubilidad, se A


tomo el tubo D en el cual es ms soluble la
casena y de acuerdo a ello, realizamos en esta
solucin la prueba del Biuret. Observamos y
tomamos nota.

REACCIO

2.4. Prueba Xantoproteica:

+ NaOH al
1%

3 GOTAS
DE

CuSO4

PRUEBA
POSITIVA

Efectuamos la prueba Xantoproteica en una pequea porcin de casena.


Observamos y tomamos nota.

CASEN
A

PRUEB
A
POSITI

3. PROTENAS
COAGULABLES:

a) En un tubo de ensayo mediano vertimos 5 ml de suero obtenido en 1c) y lo


neutralizamos con unas gotas de solucin de NaOH al 1% (usamos papel indicador).
Luego aadimos unas cuantas gotas de cido actico hasta una ligera acidez.
Calentamos hasta ebullicin. Observamos y tomamos nota.
b) Seguimos calentando el tubo hasta reducir su volumen a la mitad, y dejamos decantar.
Separamos el slido obtenido y efectuamos la prueba de Fehling y la Xantoproteica,
por separado. Anotamos nuestras observaciones.

5 gotas
de NaOH
al 1%

3 gotas de
cido
actico

SUER
O

TOMA
UN
COLOR

SUER
O

V.

REACTIV
O DE
FEHLING

RESULTADOS:

1. AISLAMIENTO DE LA CASENA

CIDO
NTRIC
O

SUER
O

TOMA
UN
COLOR
AMARILL

Se obtuvieron 0.8 gramos de casena de 100 ml (equivalentes a 103 g si

consideramos su densidad de 1,030 g/ml a 15C) de leche pura de vaca, por lo que se el
rendimiento fue de 0.77% segn la siguiente frmula:

Rendi

miento

Peso seco de la
casena

X
10
0

g de leche

utilizados

0.

0.

77

10

El rendimiento de casena obtenido en esta prctica es muy bajo al rendimiento


reportado en la literatura (30 g por litro, 3%), es probable que esto se deba a que no se dej
que la casena precipitara completamente o, a la eliminacin del sobrenadante en cada una
de las centrifugaciones, proceso en el cual se pudieron arrastrar cantidades considerables de
protena junto el agua utilizada para eliminar el HCl.

Cabe mencionar que la protena no se precipit a pH de 4.6, solamente se


observaron pequeos grumos a pH de 4.0, fue entonces cuando se llevo a cabo la primera
centrifugacin.

Los solventes orgnicos voltiles se utilizaron para eliminar el resto de

grasa de la casena.
2. PROPIEDADES Y PRUEBAS CARACTERISTICAS DE LAS PROTENAS:

2.1. Composicin elemental: presencia de C, H, O y N


Al someter el tubo de ensayo que contena casena sobre la llama suave del mechero
se formo un residuo de color negruzco indicando la presencia de Carbono, tambin se
observo gotas de agua en las paredes del tubo de ensayo lo que indica la presencia de
Hidrgeno y Oxgeno, y por ltimo se observo el desprendimiento de humos
blanquecinos con un olor caracterstico a cuerno quemado lo que indica la presencia
de Nitrgeno.
2.2. Solubilidad
De los 5 tubos de ensayos marcados como A, B, C, D y E, solo fue soluble el tubo
D, que contena casena con Hidrxido de Sodio al 1%; los dems tubos de ensayo nos
dieron pruebas negativas con respecto a la solubilidad.
2.3. Prueba de Biuret
FORMULA QUMICA DEL
BIURET

Nos dio una reaccin positiva, ya que el


Reactivo de Biuret es aquel que detecta la
presencia de protenas, pptidos cortos y
otros compuestos con dos o ms enlaces
peptdicos en sustancias de composicin
desconocida.
Est hecho de hidrxido potsico (KOH) y sulfato cprico (CuSO4), junto con
tartrato de sodio y potasio (KNaC4H4O64H2O). El reactivo, de color azul, cambia a
violeta en presencia de protenas, y vira a rosa cuando se combina con polipptidos de
cadena corta. El Hidrxido de Potasio no participa en la reaccin, pero proporciona el
medio alcalino necesario para que tenga lugar.
2.4. Prueba Xantoproteica
Nos dio una reaccin positiva, ya que La reaccin xantoproteica es un mtodo que
se puede utilizar para determinar la cantidad de protena soluble en una solucin,
empleando cido ntrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas
protenas con aminocidos portadores de grupos aromticos, especialmente en
presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un lcali, se torna
color amarillo oscuro.
3. PROTENAS COAGULABLES

Al agregar NaOH al suero obtenido de la leche este cambio de color a un verde


indico, indicando que fue neutralizado, pero al agregar cido actico formo un cuajo espeso
blanquecino al fondo del tubo de ensayo, se separo el liquido que est en la superficie y se
efectu la prueba de Fehling, dndonos de un color azul a un color rojo, lo que nos indica la
presencia de glcidos tales como: lactosa y glucosa; luego realizamos la prueba de
Xantoproteica y nos dio una coloracin amarilla indicando una prueba positiva.
VI. CONCLUSIONES:

Es posible la purificacin parcial y el aislamiento de la casena de la leche, utilizando la


poca solubilidad que esta protena tiene cuando se le lleva hasta su punto isoelctrico y la
rapidez de sedimentacin de la misma al utilizar la centrifuga. No obstante, el rendimiento
puede ser variado si se considera que los mtodos de purificacin son tambin variados.
Al someter a la casena al calor suave del mechero se puede observar claramente su
composicin elemental que son: C, H, O y N, a travs del residuo negruzco, los humos
blanquecinos y las gotas de agua en las paredes del tubo de ensayo que se desprenden al
someterlo a calentamiento suave.
La casena es una protena y fue ms soluble con NaOH, es decir es soluble en solucin
alcalina.
La reaccin de Biuret es una reaccin que sirve para identificar los enlaces peptdicos de las
protenas, ya que en las pruebas realizadas nos dio positiva dndonos coloraciones de color
morado claro.

La reaccin de Xantoproteica sirve para detectar compuestos aromticos presentes en la


estructura de protenas, adems de que las protenas estn formadas por aminocidos, ya
que en las pruebas realizadas nos dio positivas dndonos un color amarillo.

VII. CUESTIONARIO

1. Responda brevemente:
a) Qu son: albminas, globulinas, seudoglobulinas y fosfoprotenas?

ALBUMINAS:
La albmina es una protena que se encuentra abundantemente en la sangre del
ser humano y es sintetizada en el hgado, representando el 54,31% de la protena
plasmtica. Normalmente tiene una presencia en sangre humana de 3,5 a 5 gramos
por decilitro.
FUNCIONES:
- Permite mantener la presin onctica, fundamental para la correcta distribucin de
los lquidos corporales - entre compartimento intravascular y el extravascular,
localizado entre los tejidos.
- Transporta las hormonas tiroideas y las hormonas liposolubles.
- Transporta cidos grasos libres y la bilirrubina no conjugada.
- Transporta muchos frmacos.
- Controla el pH.
TIPOS DE ALBUMINAS:
Seroalbmina: Es la protena del suero sanguneo.
Ovoalbmina: Es la albmina de la clara del huevo.
Lactoalbmina: Es la albmina de la leche.

GLOBULINAS:
Las globulinas son un grupo de protenas insolubles en agua que se encuentran en
todos los animales y vegetales.
Entre las globulinas ms importantes destacan las seroglobulinas (de la sangre), las
lactoglobulinas (de la leche), las ovoglobulinas (del huevo), la legmina, el
fibringeno, los anticuerpos (-globulinas) y numerosas protenas de las semillas.
Las globulinas son un importante componente de la sangre, especficamente del
plasma. stas se pueden dividir en varios grupos.
Principales grupos de globulinas:
globulinas alfa 1 y 2

globulinas beta
globulinas gamma

SEUDOGLOBULINAS:
Son protenas solubles que pueden precipitarse de una solucin acuosa por
saturacin de uno a tres cuartos con una sal acida. Las seudoglobulinas son menos
frecuentes. La podemos encontrar en el suero de la leche
se coagulan por
calentamiento.

FOSFOPROTENAS:
Protenas combinadas con cido fosfrico, o un radical que contiene fsforo que no
sea un fosfolpido ni cido nucleico. Ejemplo: casena.

b) en qu consiste la desnaturalizacin y la precipitacin de protenas?


Se llama desnaturalizacin de las protenas a la prdida de las estructuras de orden
superior (secundaria, terciaria y cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica
reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija.
La precipitacin suele ser consecuencia del fenmeno llamado desnaturalizacin y
se dice entonces que la protena se encuentra desnaturalizada. Ver figura.

c) A qu se llama punto isoelctrico?


El punto isoelctrico es el pH al que una sustancia anftera tiene carga neta cero. El
concepto es particularmente interesante en los aminocidos y tambin en las protenas.

A este valor de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula. Para calcularlo se deben


utilizar los pKa.

(Los pKa a considerar para esta ecuacin, en una tabla de pH, son los que contienen
a la especie qumica con carga igual a cero,
cuando tienen ms de un pKa).
Las
molculas complejas, tales como las protenas, se combinan con los
iones hidrgeno y con otros iones presentes en la disolucin, dando lugar a la carga
neta de la molcula. A la concentracin de iones hidrgeno, o al pH, para el cual la
concentracin del ion hbrido de una protena es mxima y el movimiento neto de las
molculas de soluto en un campo elctrico es prcticamente nulo, se le denomina punto
isoelctrico.
2. Exponga en forma ordenada todas sus observaciones sobre:

a) Preparacin de la casena. Qu es la casena y que propiedades presenta? Para


qu sirve? Qu es suero obtenido?
La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se
separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las fosfoprotenas son
un grupo de protenas que estn qumicamente unidas a una sustancia que contiene
cido fosfrico. En la casena la mayora de los grupos fosfato estn unidos por los
grupos hidroxilo de los aminocidos serina y treonina. La casena en la leche se
encuentra en forma de sal clcica (caseinato clcico). La casena representa cerca del
77% al 82% de las protenas de la leche y el 2.7% en la composicin de la leche
lquida. Y la propiedad que se vio claramente fue que las casenas precipitan a pH 4,6,
que es su punto isoelctrico (a temperatura ambiente)

E
l
suero de leche es un lquido obtenido en el proceso de fabricacin del queso y de la
casena, despus de la separacin de la cuajada o fase micelar. Sus caractersticas
corresponden a un lquido fluido, de color verdoso amarillento, turbio, de sabor fresco,

dbilmente dulce, de carcter cido, con un contenido de nutrientes o extracto seco del
5.5% al 7% provenientes de la leche.
b) Qu elementos se detectaron en la casena? Cmo los certifica? Qu ensayo
realizara para detectar la presencia de azufre?
Se detectaron el C, H, O y N, esto se vio claramente al someter a la casena a la
llama suave del mechero, se produjo un residuo negruzco (carbono), gotitas de agua en
las paredes del tubo de ensayo (oxigeno e hidrogeno) y la presencia de humos
blanquecinos (nitrgeno) y si tendramos que detectar la presencia de azufre
tendramos que realizar la reaccin de la cistina, que consiste en aadir 2 gotas de
solucin de acetato de plomo. Se obtiene un precipitado. Luego aadimos solucin de
hidrxido de Sodio para disolver este y luego hervir. La solucin se torna pardo
obscura (debido a la formacin de sulfuro de plomo).
c) En cul de las soluciones empleadas fue ms soluble la casena?

En la solucin alcalina de hidrxido de Sodio al 1%


d) Fueron positivas las reacciones del Biuret y la Xantoproteica? Escriba sus
reacciones correspondientes

REACCION DE BIURET: la prueba fue positiva y su reaccin esta dado por:

CASEN
A
HIDRXID SULFAT
O DE
O DE
SODIO
CuSO4
NaO

Na2
SO4
SULFATO
DE
SODIO

COMPLEJO TETRACOORDINADO
DE COBRE

REACCION DE XANTOPROTEICA: la prueba fue positiva y su reaccin esta dado por:

3. Exponga sus observaciones y deducciones de los ensayos sobre las protenas


coagulables. Escriba las
reacciones de Fehling y
2HN Xantoproteica.
NaO
O3

REACCIN
FEHLING:

DERIVADO

DE

DERIVADO

Al someter el suero obtenido con el licor de fehling nos da una coloracin rojiza lo
que nos indica la presencia de glcidos: como la lactosa y la glucosa.

PROTEN

REACTIVO DE
FEHLING

LACTO
SA

PRECIPITADO
ROJO
LADRILLO
GLUCO
SA

REACCIN DE XANTOPROTEICA:

Al tubo de ensayo al agregarle cido ntrico e hidrxido de sodio notamos que nos
da una coloracin amarillenta al ppdo.

VIII.

PROTEN

CIDO
COMPLEJO

BIBLIOGRAFIAS:

Gua de prcticas: PROTENAS II, proporcionada por el profesor Mgr.Ral Paredes


Medina

FACULTAD

INGENIERIA

ESCUELA

INGENIERA QUMICA

CURSO

BIOQUIMICA

FLORES

NOMBRE

BRYAN MACHICADO

MEDINA

PROFESOR

Ing. RAUL PAREDES

AO

SEGUNDO

FECHA DE ENTREGA

10 DE ENERO DEL 2012

TACNA - PERU