Extracción de la caseína y determinación del punto isoeléctrico

Carlosama, Laurita(lauritae.carlosamar@uqvitual.edu.co)
Gutierrez, Alejandra (alejandra.gutierrezs@uqvirtual.edu.co)

Practica 5
Universidad del Quindío.
Facultad de Ingeniería
Programa de Ingeniería de alimentos
Laboratorio Química de Alimentos
Docente: yeferson Ospina Balbuena
08/11/2021

Resumen

En este informe se llevó a cabo el procedimiento de extracción y separación de la caseína de una

muestra de leche entera liquida, La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo
fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. El objetivo
fue identificar el punto isoeléctrico de la caseína basado en la acción de la solución
CH3COOH/CH3COONa teniendo en cuenta que la caseína precipita en un medio acido con un
valor cercano a 4,6.

En esta practica se tomaron 10 tubos de ensayo y se agregaron diferentes concentraciones de

acido acético a una misma cantidad de caseína, la caseína formo un precipitado mas notorio en el
tubo con valor experimental de 4,51 muy cercano al esperado, con un margen de error de 4%

Introducción

Las unidades fundamentales de una proteína son los aminoácidos, los cuales contienen en sus
moléculas grupo amino y grupo carboxilo; por lo tanto tienen propiedades ácidas y básicas.
 Los aminoácidos de las proteínas se pueden obtener por hidrólisis ácida o enzimática. Estos
aminoácidos son fácilmente solubles en agua y existen como iones bipolares conocidos como
zwitterion, no como moléculas ionizadas.

Dependiendo del pH de la solución, los aminoácidos pueden tener carga positiva, negativa o
neutra; igual comportamiento tiene las proteínas.

Existe un pH en el cual los aminoácidos y las proteínas forman especies sin carga; en este valor
de acidez estas moléculas no migran en un campo eléctrico, y este valor se le llama punto
isoeléctrico o pH isoeléctrico. En el pH isoeléctrico las proteínas tienen la menor solubilidad,
conductividad, presión osmótica y la menor viscosidad.

Punto isoeléctrico

Aunque la mayoría de los grupos carboxilos y los grupos aminos de los aminoácidos se
encuentran bloqueados cuando se encuentran unidos para formar uniones peptídicas, siempre
quedan libres algunos de estos grupos, ya sea en los extremos de las cadenas polipeptídicas, o en
las cadenas laterales de los aminoácidos acíclicos y básicos. La disociación de los grupos
ionizables que están presentes en las proteínas ocurre como en el caso de los grupos ionizables
de los aminoácidos individuales y es gobernada por el pH del medio en el que se encuentra la
proteína. A pH = 7.1 o en valores cercanos son los habituales en la mayoría de células, los
grupos carboxilo de los ácidos aspártico y glutámico se encuentran en sus formas básicas
cargadas negativamente, mientras que los aminoácidos lisina y arginina están presentes en su
forma acrílica, cargadas positiva.

Cuando el pH de la solución es tal que la carga neta de la molécula proteica es cero, es decir,
cuando el número de total de cargas negativas iguala a número total de cargas positivas presentes
en la molécula, se llama a este valor de pH, punto ¡isoeléctrico de la proteína.

La caseína

La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche
por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que
están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la
 mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina
y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de sal cálcica (caseinato cálcico). La
caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en
composición de la leche líquida, la caseína se compone de diversos residuos de aminoácidos
entre los que se destaca el glutamato y la leucina que forma puentes.

Materiales y métodos

Materiales

 10 beakers de 25 ml
 1 probeta
 embudo de vidrio
 espátula
 balanza analítica
 2 beakers de 50 ml
 1 matraz aforado de 50 ml
 termómetro
 pera de succión
 ph- metro
 1 beaker de 250 ml
 pipetas de 1,5 y 10 ml
 estufa y placa
 frasco lavador

Reactivos

 agua destilada
 CH3COOH 0.01N
 Eter etílico
  CH3COOH 1,0 N
 CH3COONa 1,0 N
 Etanol al 70 %
 CH3COOH 1,0 N
 NaOH 1N

Para este laboratorio se uso leche entera liquida

Procedimiento

Inicialmente se tomó un vaso de precipitado y agregaron 150 ml de agua destilada y se

calentaron a 38ºC

Figura 1y2. Verificación de la cantidad y temperatura del agua

Luego se midieron 50 ml de leche y se agregaron al agua

Figura 3y4. Verificación y mezclade de la leche

Después gota a gota y con agitación, se adiciono acido acético 1N hasta

observar que se formo un precipitado
(la leche se corta).

Figura 5y6. Adición de acido acético

Figura 8y9. Verificación del precipitado .

 posteriormente se procedió a filtrar la
muestra y lavar el precipitado con 20 ml
de etanol

Figura 10. Filtrado y lavado de la proteína

Este precipitado se seco y se coloco en un recipiente que estaba previamente pesado luego se
adiciono 5mL/g de éter etílico. Y se filtro nuevamente. Desechamos el liquido y quedo
solamente el precipitado (la caseína).

Figura 11. Peso de la caseína

 Preparación de la solución
de caseína:

Se colocaron 250 mg de
caseína en un vaso de 50 ml
y se agregaron 20 ml de agua
destilada y 5 mL de NaOH
1N.

Figura 12. Adición de agua destilada y NaOH

Se agito bien hasta lograr una mezcla homogénea, una vez estaba disuelta lo vertimos en un
matraz aforado de 50 ml y se agregaron 5 ml de acido acético 1N y se diluyo con agua destilada
hasta obtener los 50 ml

La solución debe ser clara y limpia y si no es así́, debe volver a filtrar.

• Determinación del pi de la caseína:

 En diez vasos de 25 ml limpios y secos se adiciono exactamente los volúmenes de los
reactivos según la siguiente tabla:

Vaso Acetato
Figura 0,1 N Acético
13. Determinación de 0,1 N isoeléctrico
punto Acético 0,01 N pH resultante (aprox.)
1 0,5 9,5 - 3,2
2 1 9 - 3,6
3 1,5 8,5 - 3,8
4 2 8 - 4,0
5 3 7 - 4,2
6 4 6 - 4,5
7 5 4 - 4,7
8 6 2 - 5,1
9 7 . 4 5,5
10 8 - 2 6,1

Tabla1. Medidas para preparación de soluciones

Se midió experimentalmente el pH de todos los vasos, se añadió 1

ml de disolución de caseína a cada vaso y se agitaron.

Figura 13. Calculo de pH

Luego esperamos 3 minuto, pasado este tiempo se midió la absorbancia de cada muestra a 640
nm con las cubetas de colorimetría de 1 cm de paso óptico, teniendo la precaución de agitar bien
el contenido de cada vaso para obtener una solución / suspensión homogénea

Resu
ltados y discusión

Extracción de la caseína

Al adicionar el ácido acético a la leche se observa un cambio en su composición, evidenciándose

una precipitación completa, ya que la fase líquida es traslúcida y la fase sólida completamente
blanca.
Se puede explicar ya que de acuerdo al cambio de pH experimentado por la leche, inicialmente
de 6,685 allí la proteína (caseína) se encuentra cargada negativamente solubilizada con sal
cálcica, al acidificarse el pH se acerca al punto isoeléctrico de la proteína, al llegar a pH
aproximado a 4,5-4,7se neutraliza la caseína (los grupos fosfatos se protonan), así se precipita
debido a que hay menos repulsiones intermoleculares, evidenciándose la separación de estos
compuestos por medio de densidad ya que la densidad del agua es 1 g/ml quedando arriba por
tener densidad más baja que la caseína que es de 1.3g/ml, esta separación se da debido a que
cuando las proteínas en este caso la caseína se encuentra a pH de punto isoeléctrico son menos
solubles en agua y se da la separación de la proteína y el agua.
Ca2 + Caseinato + CH3COOH Caseína + CaCOOH

Después de precipitada la caseína, se procede a lavado para eliminar el suero y grasas forzando a
la parte soluble de la caseína con la lactosa a cristalizar.

Determinación del punto isoeléctrico

 Con una preparación previa de más soluciones se prepararon las soluciones para medir su
correspondiente absorbancia

Vas Acético 0,1

Acetato 0,1 N Acético 0,01 N pH resultante (aprox.)
o N
1 0,5 9,5 - 3,2
2 1 9 - 3,6
3 1,5 8,5 - 3,8
4 2 8 - 4,0
5 3 7 - 4,2
6 4 6 - 4,5
7 5 4 - 4,7
8 6 2 - 5,1
9 7 . 4 5,5
10 8 - 2 6,1

Tabla1. Medidas para preparación de soluciones

Se obtuvieron los siguientes resultados correspondientes a la medición de la absorbancia de la

muestra de caseína a diferentes pH en diferentes tubos de ensayo (10) a 640 nm

Tubo pH 640nm(ABS)
1 3,28 0,4553
2 3,515 0,4422
3 3,707 0,5622
4 3,829 0,6171
5 4,038 0,6161
6 4,280 0,6758
7 4,510 0,7428
8 4,640 0,5613
9 4,748 0,5762
10 5,019 0,4608
Tabla2. Medidas de las absorbancias de la caseína a diferentes pH en la solución

Con estos datos obtenidos se realizo la grafica de pH VS absorbancia en la que se muestra el

comportamiento de las soluciones
 0.8 Ph Vs Abs
0.74
0.7
0.6
0.5
A
0.4
b 640nm(abs)
0.3
s
0.2
0.1
0
3 3.5 4 4.5 5 5.5
Ph
Grafica1. Medida de pH vs absorbancia para la determinación e punto isoeléctrico

según la grafica el punto isoeléctrico esta el punto isoeléctrico es el punto 4,51, ya que se puede
observar un aumento significativo de la absorbancia respecto al pH

según Miguel calvo en bioquímica de alimentos la caseína tiene un pH de precipitación de

alrededor de 4,5-4,7 este valor nos permite sacar un porcentaje de error para nuestro
experimento

teorico−experimetal
%error= *100
teorico

4,7−4,51
%error= ∗100 =4%
4,7

Conclusiones

 se logro la debida separación de la caseina mediante la acidificación

  se determino que el punto isoeléctrico experimental fue de 4,51 mediante la
interpretación de la grafica del pH Vs absorbancia, el margen de error con respecto a su
valor teórico de ph4,7 fue cerca de 4%

Cuestionario

1) Representar A 640 frente al pH de cada tubo en el apartado 3. ¿Qué sucedería si se

representa la transmitancia?

La trasmitancia nos daría una medida física de la relación de intensidad incidente trasmitida
al pasar por la muestra. La relación entre % T y la concentración no es lineal, pero asumiría
una relación logarítmica inversa. Además se obtendrían mayores lecturas
La absorbancia está en términos de la transmitancia 𝐴 = − ?𝑜𝑔 (𝑇).

2) ¿Cual es el punto isoeléctrico de la caseína?

El pI de la caseína es de 4,6 que es donde el pH al cual se precipitan.

3) ¿Por qué las proteínas tienen solubilidad mínima en el pI?

La solubilidad de una proteína es mínima en su punto isoeléctrico, ya que su carga neta es

cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión electrostática que pudiera dificultar la
formación de agregados. Dicho en otras palabras, las proteínas son menos solubles en su
punto isoeléctrico si las demás condiciones permanecen iguales. Esto se debe a que los
iones dipolares no presentan carga neta y cristalizan en forma de sales insolubles a ese
pH.
 Referencias bibliográfica

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