Practica 1: EXTRACCIÓN DE LA CASEINA Y

DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELECTRICO

Nombres de los alumnos: Cota Valdez Naydelin Adriana y Jesús Antonio Cruz Montoya
Docente: Dra. Castro Ochoa Lelie Denise
Instituto Tecnológico de los Mochis, Materia: Bioquímica, Grupo: T2N

Resumen.  “El pH isoeléctrico se determinó de acuerdo al valor en el cual el precipitado presentó mayor
contenido de proteína, y se refiere al pH donde la proteína no tiene carga eléctrica y es incapaz de
desplazarse en un campo eléctrico, por lo que no existe repulsión electrostática entre las moléculas de
proteína vecinas y tienden a precipitar” (1). En esta esta práctica se hicieron disoluciones para separar
e identificar en punto isoeléctrico y así poder ver las proteínas de la leche.

Introducción aproximadamente, estando a ese pH la

En la leche hay tres clases de proteínas:
caseína, lacto albúminas y lacto globulinas
(todas globulares). La caseína es una
proteína conjugada de la leche del tipo
fosfoproteína que se separa de la leche por
acidificación y forma una masa blanca. Las
fosfoproteínas son un grupo de proteínas
que están químicamente unidas a una
sustancia que contiene ácido fosfórico. En
la caseína la mayoría de los grupos fosfato
están unidos por los grupos hidroxilo de los
aminoácidos serina y treonina. La caseína
en la leche se encuentra en forma de sal
cálcica (caseinato cálcico). La caseína
representa cerca del 77% al 82% de las
proteínas presentes en la leche y el 2,7%
en composición de la leche líquida. La
caseína está formada por alpha(s1),
alpha(s2)-caseína, ß-caseína, y kappa-
caseína formando una micela o unidad
soluble. Ni la alfa ni la beta caseína son
solubles en la leche, solas o combinadas. Si
se añade la kappa caseína a las dos
anteriores o a cada una de ellas por
separado se forma un complejo de caseína
que es solubilizado en forma de micela.
Esta micela está estabilizada por la kappa
caseína mientras que las alfa y beta son
fosfoproteínas que precipitan en presencia
de iones calcio. La propiedad característica
de la caseína es su baja solubilidad a pH
4,6. El pH de la leche es 6,6
caseína cargada negativamente y
solubilizada como sal cálcica. Si se añade
ácido a la leche, la carga negativa de la
superficie de la micela se neutraliza (los
grupos fosfato se protonan) y la proteína
neutra precipita.
PUNTO ISOELECTRICO
Todas las macromoléculas de la naturaleza
adquieren una carga cuando se dispersan
en agua. Una característica de las proteínas
y otros biopolímeros es que la carga total
que adquieren depende del pH del medio.
Así, todas las proteínas tienen una carga
neta dependiendo del pH del medio en el
que se encuentren y de los aminoácidos
que la componen, así como de las cargas
de cualquier ligando que se encuentre
unido a la proteína de forma covalente
(irreversible).
Debido a la composición en aminoácidos
de la proteína, los radicales libres pueden
existir en tres formas dependiendo del pH
del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.
Cualquier proteína tendría una carga neta
positiva si se encuentra en un medio lo
suficientemente ácido debido a que los
grupos COOH de los aminoácidos aspártico
y glutámico estarían en su forma neutra
pero los grupos amino de Arginina y lysina
estarían protonados (-NH3 + ). De igual
forma si la proteína se encuentra en un
medio con un pH muy alto estaría cargada
negativamente ya que en este caso los
grupos carboxilo estarían desprotonados
(COO - ) y los grupos amino estarían en su
forma neutra (NH2). De lo anterior se
deduce que las proteínas tienen un pH
característico al cual su carga neta es cero.
A este pH se le denomina punto
isoeléctrico (pI). En el punto isoeléctrico
(pI), se encuentran en el equilibrio las
cargas positivas y negativas por lo que la
proteína presenta su máxima posibilidad
para ser precipitada al disminuir su
solubilidad y facilitar su agregación.
Materiales y Métodos
1. DETERMINACION DEL PUNTO
ISOELETRICO
1.1 Preparación de una serie de
tubos con solución amortiguadora
de acetatos.
2. PREPARACIÓN DE LA LECHE
2.1 En un vaso de precipitados de
100 ml disuelve 6 gr. De leche en
polvo descremada, con 50 ml de
agua destilada. NOTA: Añade el
agua poco a poco para evitar que
se formen grumos que podrían
dificultar la obtención de una
solución homogénea. No debes
calentar la leche para disolverla.
2.2 En un tubo de ensayo de 16 x
150 mm mide 2 ml de leche
rehidratada preparada como se
indico anteriormente y añade 8 ml
de agua destilada, agita
cuidadosamente por inversión.
Esta muestra de leche diluida (1:5)
se ocupara para llevar a cabo la
determinación del punto
isoeléctrico de las proteínas.
3. PUNTO ISOELÉCTRICO
3.1 Añade 1 ml de la leche diluida
(1:5) a cada tubo de solución
amortiguadora que preparaste en
el punto 1.
3.2 Mezcla cuidadosamente por
inversión todos los tubos y deja
reposar por espacio de 10
minutos. Observa el aspecto de las
mezclas preparadas. En el tubo
donde observes
grumos de leche suspendidos en
la solución te indicará que las
proteínas de la leche se han
insolubilizado debido al pH de la
solución este pH es denominado
punto isoeléctrico.
3.3 Centrifuga los tubos a 2500
r.p.m durante 10 minutos NO SIN
ANTES BALANCEARLOS. Deberá
pesar lo mismo que aquel tubo que
ocupará el lugar opuesto dentro de
la centrifuga.
3.4 Separa el sobrenadante
(cuidando de no suspender el
precipitado acumulado en el fondo
del tubo) y transfiere a tubos
limpios de 15 x 100 rotulados con
el número de tubo que les
corresponde.
4. En nuestro caso la caseína ya estaba
preparada por lo que determinaremos eI pI
de la caseína: En los tubos de ensayo
limpios y secos adicione exactamente los
volúmenes de los reactivos según la
siguiente tabla:
 4 4 0.602
5 4.32 0.585
6 4.45 0.693
7 4.76 0.56
8 5.02 0.2
9 5.41 0.166
10 5.77 0.246

Representamos de una manera más

perceptible la interacción de la caseína en
distintos pH en el siguiente gráfico:
Medir experimentalmente el pH de todos
los vasos, que debe cubrir un rango
aproximado semejante al teórico (3 a 6,5).
Anotar los valores reales en la Tabla, que
deben ser semejantes a los expresados o,
en todo caso, crecientes.

- Añadir 1 ml de disolución de caseína a

cada tubo.

- Agitar suavemente cada uno y esperar

aproximadamente 3 minutos.

- Medir la absorbancia de cada muestra a El punto más alto en la gráfica es la

640 nm con las cubetas de colorimetría de
1cm de paso óptico, teniendo la precaución
de agitar bien el contenido de cada tubo
para obtener una solución / suspensión
homogénea antes de verter una parte en la
cubeta.
- Anotar resultados, representar la
absorbancia frente al pH, y determinar el pI
aproximado de la caseína.
Resultados y discusión
Obtuvimos caseína de una muestra de leche
a partir de la acidificación y posteriormente
acondicionamos una solución de caseína la
cual ya estaba preparada en tubos de ensaye
a diferentes pH obteniendo distintas
absorbancias registradas en la siguiente
tabla:
absorbancia más alta registrada (0.693)
correspondiente al tubo con un pH de 4.45,
la absorbancia aumenta conforme aumenta
el grado de turbidez en cada solución, por
lo tanto, el tubo con un pH de 4.45 es el que
tiene mayor grado de turbidez, este indica
que hay un mayor contenido de precipitado.
El punto isoeléctrico es el valor del pH
cuando la carga neta de la proteína es 0 y
por lo tanto esta no se disocia, es decir, se
presenta en forma de precipitado. Por lo
tanto, el pH más cercano al punto
isoeléctrico de la caseína resultante es:
PI=4.45
Anexos

TUBO pH experimental Absorbancia

1 3.54 0.527
2 3.77 0.449
3 3.93 0.502
 Fig. 1. Separación de las proteínas en la solución

Bibliografía

1.

Serpa Guerra, A. M., Hincapié Llano, G., & Álvarez López, C. (2014). Determinación del punto isoeléctrico de las
proteínas. SCIELO, 40-43.

2. Scrib (sitio en internet). Colorimetría. Disponible en: http://es.scribd.com/doc/43700968/Colorimetria-copia-3

3. Wikipedia la enciclopedia libre (sitio en internet). Ley de Beer- Lambert. Disponible en:
http://es.wikipedia.org/wiki/Ley_de_Beer-Lambert

4. www. Ehu.es (Sitio en internet). Ecuación de Henderson- Hasselbalch. Disponible

en:http://www.ehu.es/biomoleculas/buffers/hh.htm

5. Chang, R. (1999), Química Edición breve.Ed.McGraw-Hill, México.

6. https://www.academia.edu/36703078/PRACTICA-CASEINA

7. https://nadiazg.files.wordpress.com/2012/04/practica-2.pdf

8.https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf
https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomol/Practica3FQB.pdf

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