Está en la página 1de 8

Laboratorio 1.

Aporte nutricional de las macromoléculas


Autores:
José Daniel Izquierdo, Nicolás Ñustes
Facultad de ingeniería, Universidad de la Sabana
Resumen: La caseína es una de las proteínas que se encuentra en mayor proporción en la leche y está
formada por alpha (α1), alpha (α2)–caseína, β–caseína, y kappa–caseína. En este artículo, se realizaron
varios procedimientos; extracción de caseína en muestra de leche en polvo, determinación de punto
isoeléctrico de la caseína, cuantificación de proteínas presentes en la muestra de leche a 595 nm por el
método Biuret y para corroborar la presencia de caseína en la muestra se realizó electroforesis SDS PAGE
de proteínas de la leche teniendo en cuenta un marcador de peso, los resultados obtenidos
experimentalmente de punto isoeléctrico fue de 4,35 y en la electroforesis se evidenciaron bandas de 80
kDa y 32 kDa las cuales corresponden a αcaseína y Lactoferrina.
Palabras clave: caseína, electroforesis, punto isoeléctrico, método de Biuret, cuantificación de proteínas.
Abstract: Casein is one of the proteins found in a greater proportion in milk and is formed by alpha (α1),
alpha (α2) -casein, β-casein, and kappa-casein. In this article, several procedures were performed; extraction
of casein in milk powder sample, isoelectric point determination of casein, quantification of proteins present
in the milk sample at 595 nm by the Biuret method and to confirm the presence of casein in the sample,
SDS PAGE electrophoresis was performed. milk proteins taking into account a weight marker, the
experimentally obtained results of isoelectric point was 4.35 and electrophoresis showed 80 kDa and 32
kDa bands which correspond to α-casein and Lactoferrin.
Key words: casein, electrophoresis, isoelectric point, Biuret method, protein quantification.
INTRODUCCIÓN:
En la dieta del ser humano, uno de los alimentos Punto isoeléctrico (pI): es el valor de pH de las
más consumidos e importantes es la leche debido proteínas que presentan su máxima posibilidad
a que posee un alto contenido proteico. La para ser precipitadas debido a que las partículas
proteína de la leche contiene una gran cantidad de se agregan y se encuentran en el equilibrio las
aminoácidos que no se pueden sintetizar. cargas positivas y negativas presentando una
carga neta de 0 (Miller, 2001).
La proteína que se encuentra en mayor
proporción en la leche es la caseína ya que Cuantificación de proteínas por método
constituye cerca del 80% de las proteínas totales. Biuret: En este método interviene un reactivo
La caseína está formada por tres componentes que está formado por dos moléculas de urea,
alpha (α1), alpha (α2)–caseína, β–caseína, y formando el compuesto Biuret, el cual con el ión
kappa–caseína. La α y β no son solubles en la Cu2+ en medio alcalino forman el reactivo de
leche cuando se encuentran solas o combinadas. Biuret (Delgado, 2008). El reactivo reacciona con
De los tres componentes, la α-caseína es la más compuestos peptídicos que contengan más de un
importante, debido a que comprende cerca de tres enlace peptídico para formar un complejo violeta
cuartos de la caseína total, la k-caseína está entre: los cuatro grupos amino de los enlaces
presente en menor cantidad (Suetsuna, Ukeda & peptídicos y el ion cúprico (figura 1) (Herrera,
Ochi,2000). Boloaños & Lutz, 2003). La intensidad del color
del compuesto de coordinación es equivalente a
la concentración de los compuestos peptídicos, de la partícula está dada por el pH del medio y
esta característica permite que la cantidad de esta puede ser modificada por la interacción con
clase de complejos puedan ser cuantificados por pequeñas moléculas de iones u otras
métodos colorimétricos, en este caso el complejo macromoléculas. De lo anterior se deduce que el
obtenido presenta una máxima absorción a 540 pH influye sobre la velocidad de migración de las
nm. moléculas. En el punto isoeléctrico de la
biomolécula, pH al cual su carga neta es 0, esta
no migra. Por debajo del punto isoeléctrico tiene
carga neta positiva y migra hacia el cátodo, y por
encima del punto isoeléctrico tienen carga neta
negativa y migra hacia el ánodo (Garfin, 1990).
MATERIALES Y METODOS:
Aislamiento de caseína
En un vaso de precipitado calentar 100mL de
Fig.1. Reacción de formación de complejo en agua destilada a 38°C, añadir 50mL de leche y
la determinación de proteínas por el método tener cuidado en que la temperatura no cambie.
Biuret. (Herrera, Boloaños & Lutz, 2003) Luego agregar ácido acético 1N gota a gota con
Electroforesis en gel: es un método para separar, bureta y con agitación, hasta identificar la
identificar y purificar DNA, RNA o proteínas, formación de un precipitado.
entre las matrices más utilizadas se encuentra la Precipitar, centrifugar y guardar (solución A)
de azarosa (para ácidos nucleicos) y la de para utilizar en procedimiento de electroforesis.
poliacrilamida (para proteínas y ácidos nucleicos Adicionalmente, lavar el precipitado con 20mL
pequeños). La localización de la biomolécula en de etanol y centrifugar nuevamente (solución B).
el gel puede ser determinada mediante la
utilización de distintos colorantes que tienen Pesar un vaso de precipitado pequeño y colocar
afinidad específica por la biomolécula a resolver. el precipitado en él, volver a pesar el vaso; a
El fenómeno denominado electroforesis sucede continuación, adicionar 10 mL de éter etílico,
cuando una molécula con una carga neta en centrifugar y recoger centrifugador (solución C).
solución se desplaza por acción de un campo El precipitado blanco obtenido finamente es la
eléctrico; de esta manera la molécula migra hacia caseína.
uno u otro electrodo según su carga: los aniones
Preparación de solución de caseína
(-) irán hacia el ánodo (+) y los cationes (+) hacia
el cátodo (-). En estas condiciones las moléculas Pesar 250mg de caseína y adicionarlo en un vaso
disueltas migran a una velocidad proporcional a de precipitado de 50mL. Agregar 20mL de agua
la relación carga: masa. Por lo tanto, la velocidad destilada y 5mL de NaOH 1N, agitar hasta
de migración en estas condiciones a través del completar la disolución total de la caseína.
campo eléctrico dependerá de: carga neta, tamaño
y forma de la molécula, fuerza del campo Verter la disolución de caseína en un matraz
eléctrico, fuerza iónica, viscosidad y temperatura aforado de 50mL, adicionar 5mL de ácido acético
del medio (Chávez, Diaz & Perez, 1990). 1N y diluir con agua destilada hasta 50mL. La
solución debe ser clara y limpia.
La mayoría de las macromoléculas (proteínas,
ácidos nucleicos y polisacáridos) poseen Determinación del punto Isoeléctrico de la
determinada carga eléctrica con grupos aniónicos caseína
y catiónicos capaces de disociarse. La carga neta
Colocar en 10 vasos limpios y secos los Leche 1,6 - 0,01 - 1,2
siguientes volúmenes de los reactivos: Sln A - - - 1,8 1,2
Sln B - - - 1,8 1,2
Tabla 1. Volúmenes a utilizar de cada uno de Sln C - - - 1,8 1,2
los reactivos para determinación del pH Sln D - - - 1,8 1,2
Ácido Ácido pH
Acetato
acético acético resultante
Tubo sódico
0,1N (ml)
0,1N 0,01N aproximado Agitar suavemente y esperar 15min a que se
(ml) (ml)
1 0,5 9,5 - 3,2
desarrolle el color en la oscuridad y medir la
2 1,0 9,0 - 3,6 absorbancia de cada tubo a 595nm.
3 1,5 8,5 - 3,8
4 2,0 8,0 - 4,0 Electroforesis de las proteínas de la leche
5 3,0 7,0 - 4,2
6 4,0 6,0 - 4,5
7 6,0 4,0 - 4,7
Preparación de gel de corrida: Ensamblar, según
8 8,0 2,0 - 5,1 instrucciones, el cassette que consta de soportes,
9 6,0 - 4,0 5,5 vidrios y separadores. Preparar el gel de corrida.
10 8,0 - 2,0 6,1
Por lo general se preparan 10ml de acrilamida
10% así:
Medir pH de los vasos, que deben cubrirse en un
Tabla 3. Volúmenes a utilizar de los reactivos
rango aproximado entre 3,0 y 6,5. Los valores
obtenidos deben ser semejantes a los expresados para la preparación del gel de corrida
anteriormente. Solución Volumen
Agua destilada 4mL
Añadir 1mL de la solución de caseína a cada
Acrilamida-bisacrilamida 30% 3.3mL
vaso. Guardar la fracción sobrante, como
Tris/HCl 1.5 M pH 8.8 2.5mL
solución D.
SDS 10% 100µL
Agitar suavemente y esperar aproximadamente 3 Persulfato de amonio 10% 100µL
minutos, luego medir la absorbancia de cada TEMED 4µL
muestra a 640nm con cubetas de colorimetría de
1cm de paso óptico. Verter cuidadosamente la solución de acrilamida
Cuantificación de proteínas de la leche con una pipeta Pasteur en el contenedor
representado por 2 vidrios sujetos al cassette y
Preparar las siguientes reacciones en 10 tubos de distanciados por unos separadores. Dejar
ensayo: aproximadamente 1,5cm de distancia entre la
solución de acrilamida y el vidrio frontal.
Tabla 2. Volúmenes a utilizar de cada una de
las soluciones en la cuantificación de proteínas Luego de añadido el gel de corrida y previo a la
polimerización, añadir suavemente agua
Agua (mL)

Albumina

destilada para evitar que el borde del gel


Extracto

Biuret
Leche
Tubo

(mL)

(mL)

(mL)

(mL)

polimerice de manera irregular. Esperar unos


15min para una polimerización total del gel.
Preparación de gel de apilamiento: Luego de
B 1,8 - - - 1,2 polimerizado el gel de corrida, descargar el agua
1 1,6 0,2 - - 1,2
de la superficie del mismo y preparar 4ml del gel
2 1,4 0,4 - - 1,2
de apilamiento (4%) según se muestra a
3 1,2 0,6 - - 1,2
continuación:
4 1,0 0,8 - - 1,2
5 0,8 1,0 - - 1,2
Tabla 4. Volúmenes a utilizar de los reactivos Al finalizar la corrida extraer los vidrios del
para la preparación del gel de apilamiento cassette cuidadosamente y separarlos de manera
tal que el gel quedara posado sobre uno de los
Solución Volumen vidrios. Sumergir el gel en una solución colorante
Agua destilada 2.7mL
(1g de azul de Coomassie, 459ml de metanol,
Acrilamida-bisacrilamida 30% 0.67mL
450ml de agua destilada y 100ml de ácido acético
Tris/HCl 1M pH 6.8 0.5mL
glacial) por 3 horas. Transcurrido el tiempo,
SDS 10% 40µL
sumergir el gel en una solución decolorante
Persulfato de amonio 10% 40µL
TEMED 4µL (100ml metanol, 100ml de ácido acético glacial,
800ml de agua destilada) para eliminar las
asociaciones inespecíficas del gel al colorante. Y
Verter suavemente el contenido del gel de finalmente identificar las bandas proteicas.
apilamiento sobre el gel de corrida polimerizado
y colocar el peine cuidadosamente para que no se RESULTADOS Y DISCUSIÓN:
formen burbujas. Esperar unos 10min hasta que Los datos obtenidos de la medición de pH y las
polimerice la acrilamida. absorbancias en los 10 tubos se encuentran
Colocación de las muestras consignados en la tabla 5.

Cuando el gel de apilamiento haya polimerizado, Tabla 5. Determinación del punto Isoeléctrico
colocar el cassette en el tanque de electroforesis de la caseína
con aproximadamente 500mL del tapón de Tubo pH Absorbancia
corrida en el cual se encuentran los electrodos
1 3,32 0,424
sumergidos. Quitar cuidadosamente el peine para
que quedaran libres los pocillos del gel. Colocar 2 3,62 0,471
cuidadosamente las muestras con una micro 3 3,81 0,681
pipeta. 4 3,94 0,843
5 4,2 0,647
Muestras:
6 4,35 1,447
- Leche en polvo 2µL, Colorín 18µL (Solución 7 4,79 0,229
con Azul de Coomassie) 8 5,08 0,199
- Solución A 10µL, Colorín 10µL 9 5,32 0,21
10 5,61 0,266
- Solución B 10µL, Colorín 10µL
- Solución D 10µL, Colorín 10µL La grafica de los valores de absorbancia en
Someter las muestras mencionadas anteriormente función del pH se encuentran registrados en la
a calentamiento (100°C) por 5 minutos e Fig., 2.
inmediatamente sacarlas a baño de hielo, luego
sembrar 20µL de las muestras en los pocillos de
los geles de la electroforesis. Incluir un estándar
de peso molecular en uno de los pocillos (10µL).
Someter las muestras a electroforesis aplicando
una corriente de 100mA y observar la corrida por
40 minutos.
5 4,2 0,225
Punt o I s o eléct rico
6 4,35 0,035
1,6
7 4,79 0,59
1,4
8 5,08 0,632
1,2 9 5,32 0,616
Absorbancia

1 10 5,61 0,542
0,8
0,6
0,4 Punto Isoelectrico
0,2 0,7

0 0,6
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 0,5

Transmitancia
pH
0,4
0,3
Fig.2. Absorbancia vs pH a 640nm en
0,2
soluciones de caseína.
0,1
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos (ver
0
fig.2) se obtuvo un punto isoeléctrico de la
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6
caseína de 4,35, este valor es aproximado al
pH
reportado en la teoría es de 4,6, en este se presenta
un menor grado de solubilidad
(Swaisgood,1992). Dado que el valor obtenido Fig.3. Transmitancia vs pH a 640nm en
experimentalmente es cercano al teórico, se soluciones de caseína.
puede inferir que se realizó correctamente la
extracción de caseína lográndose obtener el En representación del punto isoeléctrico en
precipitado deseado. función de la transmitancia vs pH consignada en
la fig.3 se demuestra que el punto isoeléctrico
Las proteínas tienen solubilidad mínima en el tiende a disminuir con respecto al punto
punto isoeléctrico debido a que su carga neta es isoeléctrico.
cero y desaparece cualquier fuerza de repulsión
electrostática que dificulte la formación de Los datos obtenidos de absorbancia y
agregados. concentración para la solución patrón (Albúmina)
se encuentran consignados en la tabla 7.
La representación de la transmitancia para la
determinación del punto isoeléctrico de la caseína Tabla 7. Datos de concentración y absorbancia
se encuentra consignada en la tabla 6 y fig. 3. de albúmina

Tabla 6. Determinación del punto Isoeléctrico Concentración (mg/mL) Absorbancia


de la caseína (pH vs trasmitancia) 0,333 0,077
0,666 0,155
Tubo pH Transmitancia
1 0,197
1 3,32 0,375
1,333 0,247
2 3,62 0,338
1,666 0,26
3 3,81 0,208
4 3,94 0,143
La grafica de los valores de absorbancia en Tabla 9. Concentración y de la caseína
función de la se encuentran registrados en la Fig., cuantificada
4.
Solución Absorbancia Concentración
Curva de calibración de albúmina A 0,272 1,293
B 0,897 4,932
0,3
D 0,249 1,158
0,25

0,2
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la
Absorbancia

tabla 9. Se identifica que la solución B contiene


0,15 una mayor concentración de caseína que la
y = 0,1374x + 0,0498 solución A y C, esto se debe a que se realizó un
0,1 lavado con etanol, el cual contribuye a la
desnaturalización de proteínas, en este caso de la
0,05 caseína.
0 Es importante tener en cuenta que el método de
0 0,5 1 1,5 2 Biuret tiene una sensibilidad muy baja, por esta
Concentracion (mg/mL) razón requiere de una mayor cantidad de muestra
Para la detección de proteínas es recomendable
Fig.4. Curva de calibración de albumina emplear cantidades entre 0,001 – 0,2 g de
proteína·mL-1.También se debe tener en cuenta
(Absorbancia vs concentración)
que algunas veces en el método
De la curva de calibración Fig.3. se obtiene la espectrofotométrico se tienen desviaciones en la
siguiente ecuación: y = 0,1374x + 0,0498. A medición de absorbancias debido a la dispersión
partir de la ecuación de la recta, se determina la de las partículas que se encuentran suspendidas
concentración de las muestras A, B y D. (ver tabla en la solución ocasionando la obtención de una
8) absorbancia aparente. En estos casos se requiere
de una filtración de la muestra y una ubicación
𝑌−𝑏
𝑋= muy cercana de la misma al detector (Owen,
𝑚 2000).
Tabla 8. Concentración y absorbancia de
En cuanto al procedimiento para la elaboración
soluciones A, B, D
de la curva de calibración es importante destacar
Solución Absorbancia Concentración que la albumina sérica bovina (BSA) es empleada
debido a su capacidad para aumentar la señal en
A 0,272 1,617
los ensayos, además de su falta de efecto en
B 0,897 6,166
muchas reacciones bioquímicas y su bajo costo
D 0,249 1,448 Por otro lado, es necesario adicionar NaCl a la
BSA porque reduce sus interacciones
Teniendo en cuenta que, según Miller, la caseína electrostáticas. Esto ocurre debido a que la sal
representa el 80% de las proteínas presentes en la aumenta la fuerza iónica de la solución
leche se obtienen los siguientes resultados en provocando así una disminución de la repulsión
cuanto a la concentración de caseína, presente en electrostática entre cadenas de proteínas. De esta
la muestra problema (leche en polvo) (ver tabla manera se obtiene una acumulación de proteínas
8.) que contienen una capa de polarización más
gruesa (Zin, Penha, Rezzadori , Silva , Guizoni K, b) Tamaño: las moléculas más grandes tienen una
Petrus, 2016). movilidad electroforética pequeña en
comparación con las partículas más pequeñas.
La electroforesis obtenida después de sembrar la
muestra estudiada (leche en polvo), en los
pocillos de los geles de la electroforesis c) Forma: la proteína globular migrará más rápido
seleccionado en azul, comparado con el estándar que la proteína fibrosa.
se encuentra consignado en la fig. 5.
Campo eléctrico: es un gradiente de potencial
que logra que haya electroforesis. Este depende
de los siguientes parámetros:

- Diferencia de potencial(V): Su medida es en


voltios y define el campo eléctrico. Cuanto mayor
sea, mayor será la velocidad de migración. En la
electroforesis se considera de bajo voltaje si se
realiza entre 10-500 voltios y de alto voltaje si se
realiza entre 500-10.000 voltios.

- Intensidad (I): Su medida es en amperios y


cuantifica el flujo de carga eléctrica. Debido a que
Fig. 5 Electroforesis de proteínas presentes en
está relacionada con la diferencia de potencial por
la leche en polvo
la Ley de Ohm (normalmente se encuentra entre
Teniendo en cuenta el resultado presentado en la 5-50mA), esta da cuenta de la distancia recorrida
fig. 4. se evidencia que no es posible identificar por las moléculas.
correctamente la muestra de leche ya que se no se
observan correctamente las bandas de peso -Resistencia (R): Su medida en ohmios y cuanto
debido a la desnaturalización de la muestra. Sin mayor sea la resistencia del soporte, menor será
embargo, se evidencian se resaltan dos bandas la movilidad electroforética. Esto depende de la
una aproximadamente a 80 kDa (parte de arriba) naturaleza del soporte, sus dimensiones (anchura,
y otra a 32 kDa (Parte media). Las cuales longitud y sección) y de la concentración del
corresponden a αcaseína y Lactoferrina (Edid, buffer empleado en la electroforesis.
2011).
Buffer: Durante la electroforesis, ocurre una
Los factores que afectan las separaciones electrolisis del agua por acción del campo
electroforéticas son (Pérez, 2000): eléctrico, esto genera protones que se aproximan
al ánodo y iones hidroxilo en el cátodo. Por esta
Muestra: la relación carga / masa de la muestra razón, se emplea el buffer debido a que este evita
determina su movilidad electroforética. La masa que el ánodo se acidifique y el cátodo sea más
consiste no solo en el tamaño (peso molecular) básico, pero se debe tener precaución en que este
sino también en la forma de la molécula. no afecte a las moléculas a separar, por esto se
utilizan buffer de 0,05-0,01M. También, se debe
a) Carga: cuanto mayor es la carga, mayor es la tener en cuenta el pH del buffer, puesto que este
movilidad electroforética. La carga depende del determina la carga de la muestra.
pH del medio.
Tiempo de corrida: La determinación de este es
importante debido a que un tiempo muy corto
impide el avance de las muestras para su correcta
separación, sin embargo, se ha demostrado que Garfin.(1990). One dimensional gel
los tiempos cortos minimizan la dispersión de la electrophoresis. Methods in enzymology.;182.
muestra y el ensanchamiento de la banda.
Herrera C, Boloaños N, Lutz G (2003). Proteínas.
CONCLUSIONES: In: Química de alimentos. Costa Rica; p. 36.

Para la extracción de la caseína, se debe tener en Miller. (2001). Química de Alimentos, Manual de
cuenta el punto isoeléctrico ya que en este se Laboratorio. México
encuentran en equilibrio las cargas positivas y Owen T. (2000) Principios y aplicaciones de
negativas en la proteína generando la máxima espectroscopía Uv-visible. In: Interferencia.. p.
posibilidad de precipitarse al disminuir la
69–71.
solubilidad.
Pérez (2000)HMG. Electroforesis en geles de
Las proteínas como la caseína son susceptibles a poliacrilamida : fundamentos , actualidad e
sufrir cambios en su estructura por factores como importancia. Univ Diag.;1(2):31–41.
el cambio de pH y centrifugación generando su
desnaturalización. Swaisgood, H.E. (1992). Chemistry of the
caseins, en Advanced Dairy Chemistry, vol.1:
En la electroforesis de proteínas se determina la Proteins (Fox, P.F., ed.) Elsevier Applied
posibilidad de obtención de pesos de αcaseína y
Science. Londres, 63-110.
Lactoferrina, sin embargo, no se tiene la certeza
debido a la desnaturalización de la muestra y los Suetsuna, K., Ukeda,H., & Ochi, H. (2000).
factores que afectan las separaciones Isolation and characterization of free radical
electroforéticas. scavenging activities peptides reived from casein.
The Journal of nutrional biochemistry.
BIBLIOGRAFIA:
Zin G, Penha FM, Rezzadori K, Silva FL,
Chávez Planes M, Díaz Brito J, Pérez U, Delfín Guizoni K, Petrus JCC, et al. (2016) Fouling
J. (1990) Temas de enzimología. Tomo 2. control in ultrafiltration of bovine serum albumin
Facultad de Biología Universidad de La Habana. and milk by the use of permanent magnetic field.
Edid. (2001). Características de los alérgenos más J Food Eng [Internet].
importantes en la leche de vaca.

También podría gustarte