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FUNDAMENTO.
PRECIPITACION POR SALACION (salting out)
Si disminuye la concentración efectiva del agua, en una solución proteica añadiendo una sal
muy soluble, se aumentará la solución proteica añadiendo una sal muy soluble, se
aumentará la interacción proteína- proteína, favoreciéndose la precipitación de la proteína.
La gran cantidad de sal estará robándole a la proteína las moléculas de agua que la
solubilizan. Como las proteínas varían en la proporción de cargas superficiales como las
distintas proteínas precipitaran a distintas concentraciones de sal proporcionando esto un
método para lo que se llama la “precipitación diferencial de las proteínas”. El
procedimiento en general se llama en inglés: salting out. Es español se ha llamado:
“salado”. La sal más empleada para este efecto son las de sulfato de amonio y sulfato de
sodio. Una solución saturada de amonio es aquella que tiene 75 gr. De sulfato de amonio x
100 ml. de agua destilada.

PRECIPITACION POS SOLVENTES ORGÁNICOS

Al añadir solventes orgánicos como etanol o acetona a una solución acuosa de proteínas, se
baja la cte. Dieléctrica del agua, disminuyendo efectivamente la interacción proteína- agua
y aumentando la interacción proteína- proteína, favoreciendo así la precipitación. Si esto
sucede a más de cero grados centígrados, las proteínas se desnaturalizan, de ahí que ese tipo
de precipitación cuando se usa para purificar proteínas con actividad biológica, como las
enzimas, se tenga que hacer a bajas temperaturas. En este tipo de precipitación si hay que
tener en cuenta factores como PH, electrolitos, presencia de metales pesados, etc. Pues
pueden tener efecto en la precipitación.
PRECIPITACION POR FORMACION DE SALES
Las proteínas precipitan de sus soluciones por algunas sales de metales pesados como el
cloruro de mercurio, nitrato de plata, sulfato de cobre, etc. El ion del metal pesado, muy
probablemente se combina con la forma aniónica de la proteína. La proteína en el lado
alcalino de su punto isoeléctrico, existe como ion negativo, y así al combinarse con el ion
del metal o catión, formara lo que pudiéramos llamar: proteinatos, por ejem: proteinato de
mercurio, de plata, etc.
En cambio, los reactivos llamados reactivos “alcaloidales” que son ciertos ácidos como el
pícrico, el fosfotungstico, el tánico, el metafosforico, etc. Precipita la proteína al
combinarse el radical acido del reactivo, con la forma catiónica de las proteínas que
predomina en el lado acido de su punto isoeléctrico. Se forma entonces un precipitado que
podrían llamar por ejem: tanato de proteina, fosfotungstato de proteina, tricloroacético de
proteina.
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PRECIPITACION ISOELECTRICA.
Una manera muy sencilla de precipitar a las proteínas es el ajustar el pH de su solución a su
punto isoeléctrico. Se forma entonces un precipitado reversible, que se disolverá tanto del
lado alcalino como del lado acido del punto isoeléctrico. En el punto isoeléctrico de la
proteina, la carga neta es cero, favoreciéndose entonces la precipitación por ser ese del
punto de menor solubilidad en el agua.
REACCION DE BIURET:
El biuret es un reactivo de sulfato de cobre diluido en álcali fuerte. Es un reactivo muy
bueno para demostrar la presencia de proteínas incluso cuantificarlas. La prueba la dan
positiva todos los componentes que tengan dos o más iones peptinas, por lo cual es propio
para proteínas y péptidos. La intensidad del color se da proporcional a la cantidad de
proteínas. El color azul- morado de la reacción positiva se debe a un complejo de
coordinación entre el catión divalente de cobre y cuatro átomos de nitrógeno, dos de cada
cadena peptídica. Los dipéptidos y los aminoácidos no dan positiva la reacción, excepto
serina y treonina. Esta reacción requiere realmente grandes cantidades de proteina, de 1 a 5
miligramos, para la formación del color.
Para demostrar la precipitación proteica con solventes orgánicos, utilizaremos el etanol. A
si mismo veremos la influencia del PH en este tipo de precipitación. Demostraremos
también la precipitación con metales pesados y con reactivos alcaloidales. Se observará la
aparición de precipitados más o menos grueso con los distintos reactivos.
La precipitación por punto isoeléctrico se demostrará con una solución de acetato de
caseína 0.1 N. hecho el experimento y usando la fórmula de Henderson- Hasselbach. Se
podrá calcular el PH de cada uno de los tubos y así se determinará el punto isoeléctrico de
la caseína. Si se dispone de un potenciómetro se podrá hacer la comprobación de PH de los
distintos tubos.
Si no se dispone de bolsas para diálisis se puede hacer la prueba de BIURET con la
proteina precipitada con sulfato de amonio. La cantidad de sal interfiere un poco con la
aparición del color, pero si se trata de una prueba cuantitativa solamente, si dará el
resultado.
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Precipitación por salación (salting out)
1.Rompa un huevo y separe la
yema de la clara. Descarté la
yema y vacié la clara en un vaso
de precipitado de 250 ml.
50ml
6. Disolver el precipitado
en un vaso de precipitado
de 100 ml, añadiendo 50
ml de NaCl al 1%.
7. Al filtrado que está ya en sln al
50% (NH₄)₂SO₄, agregar (NH₄)₂SO₄
solido para llevarlo al 100% de
saturación. Reposar 10min, se
precipita la ovoalbúmina.
9.
Disolver este nuevo
precipitado en otro vaso de
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PROCEDIMIENTO.
2. Agitar la clara suavemente. No es recomendable la producción de espuma.
3. Filtrar a través de una gasa
doble. Filtrar directamente a una
probeta para calcular la cantidad
de filtrado.
5. Filtrar a través de papel filtro 4. Medir el volumen filtrado obtenido y
ordinario. El precipitado contiene
Ovoglobulina vaciarlo a otro vaso de precipitado.
la ovogobulina y el filtrado la Añadir igual volumen de una sln de
ovoalbúmina en solución. sulfato de amonio. Agitar y reposar 10
Ovoalbúmina
Solución saturada de sulfato de amonio.
8.
Filtrar a través de
papel filtro ordinario
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Reacción de Biuret.

1. Colocar en una gradilla 3

tubos de ensaye de 13 x 100 e
identificarlos.

2. Pipetee 2 ml de 3.2ml
agua destilada al Pipetee 2 ml de solución
tubo #1. de ovoalbúmina al tubo #2
y 2ml de ovoglobulina al
2ml
Ovoalbúmina Ovoglobulina

4. Agregar 2 ml del reactivo de Biuret

5. Observar el color Agitar y reposar 10 min.
desarrollado en los tubos
6. Anotar resultados y dos y tres que
observaciones. Lo que acaba de
hacer es la: Detección de proteínas
por la reacciónReacción
de Biuret.
positiva.

Precipitación por solventes orgánicos.

3. Pipetee 4 ml de agua destilada al tubo

1. Colocar en una gradilla 4 2. pipetee 3 ml de albumina de
tubos de ensaye de 18 x 150 e huevo al 0.1% a los tubos 1,2 y 3.
identificarlos.

albúmina
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6. Pipetee 1 ml solución 5. Pipetee 1 ml de hidróxido

amortiguadora de acetato de sodio 0.1 N al tubo 2.
pH
4.7 al tubo 3.
4. Pipetee 1 ml de
ácido clorhídrico 0.1 N al
tubo 1.

7. Pipetee 5 ml de etanol al 95% al cada uno de los 4 tubos.

8.

9.

Observe la turbidez

Anotar observaciones y
Precipitación por formación de sales.

1. Colocar 6 tubos de ensaye 2. Pipetee 2 ml de albumina 3. Pipetee 2 ml de agua

de 13 x 100 en una gradilla de huevo al 0.1% a los tubos destilada a los tubos 2,4 y
e 1,3 y
albúmina 6.
identifíquelos. 5.

6. Pipetee 0.5 ml de 5. Pipetee 0.5 ml de cloruro

ácido tricloroacético al de nitrato de plata al 1% a
10% a los los 4. Pipetee 0.5 ml de cloruro
de mercurio al 5% a los tubos
1 y 2.
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7. Anotar observaciones y
7. Observar la formación resultados. La reacción que se
de precipitados en los hizo es:
distintos Precipitación de ovoalbúmina