Conteo en Cámara de Neubauer

ANEXO 1 Conteo en cámara de Neubauer. Esta cámara se utiliza para conteo celular.

• • • • Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedar centrada. Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. • La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del recuadro. Conteo: Lleve la cámara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de 4X. Observará lo siguiente.

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Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la siguiente manera:

En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la

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Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no que no se cuenten. que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales células son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Gráficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. 124 . El conteo en estos campos de la cámara de conoce como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera: • Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. si la tocan o están encima de ella no se incluyen. Las células que no tocan la segunda línea son contables. Las células que tiene una X son las que no se deben contar. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan el cuadro.cuadricula hasta contar en todos los cuadros.

• Después de contar las células se procede a calcular la el numero de células por unidad de volumen. • Se promedia el número de esporas de la cámara de arriba con la de abajo. el espacio ocupado por el líquido en el que están las células que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla de cuarzo. Para esto se utiliza el área de cada cuadro. 125 . se multiplica por el factor de dilución y por un factor F igual a106 si se contó el cuadro central o 104 si se contaron los cuadros de los extremos. este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a desarrollarse el microorganismo. Si 1ml del preinoculo ? ____________ X esporas ____________ Esporas a inocular (Ej.: 1*108 esporas) Luego. obteniendo el valor X. esta cantidad se aproxima y se expresa en ul.

0. A partir de la solución de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrón con la siguientes concentraciones (g/L): 0.5 mL de H2O destilada a 0.25. Preparar una muestra blanco por dilución de 0. Agitar todas las muestras.5 mL de reactivo DNS.5 mL de cada dilución y agregar 0. 2 y 4.5 mL del reactivo de DNS. 1. Agitar y dejar en reposo 15 min.5. Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos.6 g de NaOH en H2O destilada. Enfriar con hielo. Procedimiento: • • • • • • • • Tomar 0. Adicionar 30 g de tartrato de Na y K Adicionar 1 g de DNS Aforar a 100 mL con H2O destilada Almacenar en frascos ámbar a 4 ºC Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 ºC. Adicionar 5 mL de H2O destilada. Leer a 540 nm.ANEXO 2 Método del Ácido Dinitrosalicílico (DNS) Pasos para preparar DNS: • • • • • Disolver 1. 126 .

0. Método de DNS 127 .991 a 0.5ml agua destilada Agitar y reposar 15min Leer Absorbancia λ= 540nm Figura 14.5 ml DNS Ebullición de muestra 5min Enfriar con hielo 0.999.5ml muestra problema + 0.• Realizar la curva Absorbancia versus concentración. Debe tener un coeficiente de correlación de 0.

Adicionar 0.5 mL de solución salina (NaCl) al 0.9% como blanco.5 mL de las soluciones patrón de albúmina. Procedimiento: • Servir en tubos de ensayo 0. 300 y 400 µg/mL. • • • • • Adicionar a cada tubo 0. Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patrón construir la gráfica Absorbancia vs. las muestras problema y NaCl al 0. Concentración de albúmina sérica de bovina (BSA). vortexiar durante 20 segundos. 200. Se aplica el mismo procedimiento que a las demás muestras. Deben estar marcados para conservar el orden de concentraciones para la curva.9% (P/V) de las siguientes concentraciones: 15.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu 1:1. 80. con esta se puede determinar la concentración de las muestras problema interpolando el valor 128 . Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos. Dejar enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente.9% (P/V). mezclar y dejar reposar por 10 minutos.5 mL de NaOH 2N y llevar al baño María precalentado a 100°C por un tiempo de 10 minutos.ANEXO 3 Método de Lowry Para obtener la curva estándar de Albúmina se preparan 5 soluciones patrones de Albúmina en NaCl al 0. Agregar a cada tubo 5 mL de la solución complejante. Si la concentración de Proteína es menor de 500 µg/mL se lee la absorbancia a 750 nm.2. Se prepara un blanco que no lleva Albúmina y en su reemplazo se adicionan 0. si está entre 1000 y 2000 µg/mL se lee a 550 nm.

Preparar tubos 1. La curva estándar debe tener un coeficiente de correlación (r) de 0. Figura 15. 4.de absorbancia. Mezclar en vórtex 20 Leer absorbancia Graficar Absorbancia Vs. 2.5ml de Reactivo Reposar 10 min. Ambiente 0.991 a 0. 3.999.5 y blanco 0.5ml de NaOH 2N Adicionar Calentar 100ºC 10min.5ml de solución l j t Mezclar y agitar 0. Enfriar a Tem. Método de Lowry 129 .

variando el pH de extracción del Higo y la concentración de nutrientes.75427 39 Tabla 36.140824 Total 849. Tabla 35.85077 3 418. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato en el crecimiento de A. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 1255.344E-06 2.ANEXO 4 Tablas ANOVA Este es el análisis estadístico de las tablas ANOVA para el crecimiento microbiano de microorganismos.81646351 Dentro de los grupos 1420. niger.2805993 Total 2676.684607 3 41.12229449 2. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 124.616924 12. niger.86626545 Dentro de los grupos 725. Análisis de varianza efecto de pH de extracción sobre el crecimiento de A.069663 36 20.9680654 3.34637 44 32.5615357 2.06354694 0.19714 47 130 .

99485 44 26.81646351 Dentro de los grupos 1183.163585 3 323.87615582 2. Análisis de varianza de la incidencia del pH de extracción en el comportamiento del Trichoderma harzianum ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 108.721195 12.0164E-06 2. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de Suma de Grados de Promedio de las variaciones cuadrados libertad los cuadrados Entre grupos 0.935449 3 36.90111757 131 .078109 36 9.3118164 4.01446703 2.1981014 35 F Probabilidad Valor crítico para F 0.02994747 Total 434.013558 39 Tabla 38.0302319 7.40189872 3 0.9089738 Total 2155. Análisis de varianza de la incidencia de la concentración en el crecimiento del Trichoderma harzianum ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico F Probabilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F Entre grupos 971. Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.58738133 Total 19.15843 47 Tabla 39.02126552 0.86626545 Dentro de los grupos 325.13396624 Dentro de los grupos 18.22807371 0.7962027 32 0.Tabla 37.

14744845 0. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de variaciones cuadrados libertad los cuadrados Entre grupos 0.29361912 4.187442 36 0.17674497 3 0.3995633 Total 12.01248242 2. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 0.8085088 36 0.88085737 3 1.90111757 Tabla 42.89247125 3 0.40807414 2.0682993 39 132 .99085408 0.70098 39 Tabla 41.93056632 2.86626545 Dentro de los grupos 11.7860256 32 0.16272894 0.29749042 0. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre el crecimiento de Rhodotorula. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico F Probabilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F Entre grupos 3.9627706 35 Valor crítico F Probabilidad para F 0. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.05891499 Dentro de los grupos 12.86626545 Dentro de los grupos 10.Tabla 40. Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimiento de Rhodotorula.31076228 Total 15.30023635 Total 11.

96/14.786)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.333 133 .ANEXO 5 Constante K con el programa Polymath Se utilizó el programa Polymath para hallar los valores de las constantes de K Aspergillus niger variación del pH de extracción • Aspergillus niger a pH de extracción 2 BiomasapH2 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.

96/14.96/18.3556933 • Aspergillus niger a pH de extracción 12 BiomasapH12 = (0.• Aspergillus niger a pH de extracción 7 BiomasapH7 = (0.2194934 134 .342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.334)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.

002/9.574)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.45)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.1340424 Trichoderma harzianum variación del pH de extracción • Trichoderma harzianum a pH de extracción 2 BiomasapH2 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.1203965 135 .96*exp(k*tiempo))/(1-((0.• Aspergillus niger medio de Control Biomasa Control = (0.96/13.

002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/17.002/11.6580878 136 .154)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.412)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.• Trichoderma harzianum a pH de extracción 7 BiomsapH7 = (1.2273364 • Trichoderma harzianum a pH de extracción 12 BiomasapH12 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.

428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.158)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.648)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.97329 A.9509181 137 . Niger variación de la concentración de azúcares reductores • Aspergillus niger a concentración de 30g/L Biomasa [30gr/L] = (2.002/9.• Trichoderma harzianum medio de Control BiomasaControl = (1.

• Aspergillus niger a concentración de 40g/L Biomasa [40gr/L] = (2.522)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.4580631 • Aspergillus niger a concentración de 50g/L Biomasa [50gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/28.482/14.342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.4753353 138 .

• Aspergillus niger medio de Control Biomasa Control = (2.6402406 T.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3. harzianum variación de la concentración de azúcares reductores • Trichoderma harzianum a concentración de 30g/L Biomasa [30gr/L] = (3.8190618 139 .482/13.4)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.21/12.396)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.

1414981 • Trichoderma harzianum a concentración de 50g/L Biomasa [50gr/L] = (3.21/29.• Trichoderma harzianum a concentración de 40g/L Biomasa [40gr/L] = (3.6289445 140 .412)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 1.016)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.21/11.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.

21/10.4885395 141 .• Trichoderma harzianum medio de Control Biomsa Control = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.634)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.

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