ANEXO 1

Conteo en cámara de Neubauer.

Esta cámara se utiliza para conteo celular.

• Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.

• Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.
• Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe
quedar centrada.
• Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la
distribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña
o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser
continuo en un solo intento.
• La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del
recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la
apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del
recuadro.

Conteo: Lleve la cámara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el

ocular de 4X. Observará lo siguiente.

122
• Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias,
etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizará
de la siguiente manera:

• En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las

células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las
esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio.

ƒ Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno
de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la

123
 cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la
cámara de conoce como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se
ve de la siguiente manera:

• Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda

realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células
dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa
que hay tres líneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el
momento del conteo ya que definen cuales células son contables o cuales
están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la segunda línea
son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen. Gráficamente
se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las células que tiene una X son
las que no se deben contar.

124
• Después de contar las células se procede a calcular la el numero de células
por unidad de volumen. Para esto se utiliza el área de cada cuadro, el espacio
ocupado por el líquido en el que están las células que es el mismo espacio que
hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla de cuarzo.

• Se promedia el número de esporas de la cámara de arriba con la de abajo, se

multiplica por el factor de dilución y por un factor F igual a106 si se contó el
cuadro central o 104 si se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo el
valor X.

Si 1ml del preinoculo ____________ X esporas

? ____________ Esporas a inocular (Ej.: 1*108 esporas)

Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a

desarrollarse el microorganismo, esta cantidad se aproxima y se expresa en ul.

125
 ANEXO 2

Método del Ácido Dinitrosalicílico (DNS)

Pasos para preparar DNS:

• Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada.

• Adicionar 30 g de tartrato de Na y K
• Adicionar 1 g de DNS
• Aforar a 100 mL con H2O destilada
• Almacenar en frascos ámbar a 4 ºC

Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 ºC. A partir

de la solución de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrón
con la siguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4.

Procedimiento:

• Tomar 0.5 mL de cada dilución y agregar 0.5 mL de reactivo DNS.

• Preparar una muestra blanco por dilución de 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL
del reactivo de DNS.
• Agitar todas las muestras.
• Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos.
• Enfriar con hielo.
• Adicionar 5 mL de H2O destilada.
• Agitar y dejar en reposo 15 min.
• Leer a 540 nm.

126
• Realizar la curva Absorbancia versus concentración. Debe tener un coeficiente
de correlación de 0.991 a 0.999.

0.5ml muestra
problema + 0.5 ml DNS

Ebullición de muestra
5min

Enfriar con hielo

0.5ml agua destilada

Agitar y reposar 15min

Leer Absorbancia
λ= 540nm

Figura 14. Método de DNS

127
 ANEXO 3

Método de Lowry

Para obtener la curva estándar de Albúmina se preparan 5 soluciones patrones de

Albúmina en NaCl al 0.9% (P/V) de las siguientes concentraciones: 15.2, 80, 200,
300 y 400 µg/mL. Si la concentración de Proteína es menor de 500 µg/mL se lee
la absorbancia a 750 nm, si está entre 1000 y 2000 µg/mL se lee a 550 nm. Se
prepara un blanco que no lleva Albúmina y en su reemplazo se adicionan 0.5 mL
de solución salina (NaCl) al 0.9% (P/V). Se aplica el mismo procedimiento que a
las demás muestras.

Procedimiento:

• Servir en tubos de ensayo 0.5 mL de las soluciones patrón de albúmina, las

muestras problema y NaCl al 0.9% como blanco. Deben estar marcados para
conservar el orden de concentraciones para la curva.
• Adicionar a cada tubo 0.5 mL de NaOH 2N y llevar al baño María precalentado
a 100°C por un tiempo de 10 minutos.
• Dejar enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente.
• Agregar a cada tubo 5 mL de la solución complejante, mezclar y dejar reposar
por 10 minutos.
• Adicionar 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu 1:1, vortexiar durante 20
segundos.
• Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos.

Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patrón construir la gráfica

Absorbancia vs. Concentración de albúmina sérica de bovina (BSA); con esta se
puede determinar la concentración de las muestras problema interpolando el valor

128
de absorbancia. La curva estándar debe tener un coeficiente de correlación (r) de
0.991 a 0.999.

Preparar tubos 1, 2, 3, 4,5 y blanco

Adicionar
0.5ml de NaOH 2N

Calentar
100ºC 10min.

Enfriar a
Tem. Ambiente
0.5ml de solución
l j t
Mezclar y
agitar

Reposar
10 min.
0.5ml de Reactivo

Mezclar
en vórtex 20

Leer
absorbancia

Graficar
Absorbancia
Vs.

Figura 15. Método de Lowry

129
 ANEXO 4

Tablas ANOVA

Este es el análisis estadístico de las tablas ANOVA para el crecimiento microbiano

de microorganismos, variando el pH de extracción del Higo y la concentración de
nutrientes.

Tabla 35. Análisis de varianza efecto de pH de extracción sobre el crecimiento de

A. niger.

ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico
variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F
Entre grupos 124,684607 3 41,5615357 2,06354694 0,12229449 2,86626545
Dentro de los
grupos 725,069663 36 20,140824

Total 849,75427 39

Tabla 36. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato en el

crecimiento de A. niger.

ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico
variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F
Entre grupos 1255,85077 3 418,616924 12,9680654 3,344E-06 2,81646351
Dentro de los
grupos 1420,34637 44 32,2805993

Total 2676,19714 47

130
Tabla 37. Análisis de varianza de la incidencia del pH de extracción en el
comportamiento del Trichoderma harzianum

ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico
variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F
Entre grupos 108,935449 3 36,3118164 4,02126552 0,01446703 2,86626545
Dentro de los
grupos 325,078109 36 9,02994747

Total 434,013558 39

Tabla 38. Análisis de varianza de la incidencia de la concentración en el

crecimiento del Trichoderma harzianum

ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico
variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F
Entre grupos 971,163585 3 323,721195 12,0302319 7,0164E-06 2,81646351
Dentro de los
grupos 1183,99485 44 26,9089738

Total 2155,15843 47

Tabla 39. Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimiento
de Saccharomyces cerevisiae.

ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de
las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico
variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F
Entre
grupos 0,40189872 3 0,13396624 0,22807371 0,87615582 2,90111757
Dentro de
los grupos 18,7962027 32 0,58738133

Total 19,1981014 35

131
Tabla 40. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre el
crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.

ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico
variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F
Entre grupos 0,89247125 3 0,29749042 0,99085408 0,40807414 2,86626545
Dentro de los
grupos 10,8085088 36 0,30023635

Total 11,70098 39

Tabla 41. Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimiento
de Rhodotorula.

ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico
variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F
Entre grupos 0,17674497 3 0,05891499 0,14744845 0,93056632 2,90111757
Dentro de los
grupos 12,7860256 32 0,3995633

Total 12,9627706 35

Tabla 42. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre el

crecimiento de Rhodotorula.

ANÁLISIS DE VARIANZA
Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico
variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F
Entre grupos 3,88085737 3 1,29361912 4,16272894 0,01248242 2,86626545
Dentro de los
grupos 11,187442 36 0,31076228

Total 15,0682993 39

132
 ANEXO 5

Constante K con el programa Polymath

Se utilizó el programa Polymath para hallar los valores de las constantes de K

Aspergillus niger variación del pH de extracción

• Aspergillus niger a pH de extracción 2

BiomasapH2 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.786)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 1.333

133
• Aspergillus niger a pH de extracción 7

BiomasapH7 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.342)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 2.3556933

• Aspergillus niger a pH de extracción 12

BiomasapH12 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/18.334)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 2.2194934

134
• Aspergillus niger medio de Control

Biomasa Control = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/13.574)*(1-exp(k*tiempo))))

k = 1.1340424

Trichoderma harzianum variación del pH de extracción

• Trichoderma harzianum a pH de extracción 2

BiomasapH2 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.45)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 2.1203965

135
• Trichoderma harzianum a pH de extracción 7

BiomsapH7 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/11.412)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 2.2273364

• Trichoderma harzianum a pH de extracción 12

BiomasapH12 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/17.154)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 2.6580878

136
• Trichoderma harzianum medio de Control

BiomasaControl = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.648)*(1-exp(k*tiempo))))
k = 0.97329

A. Niger variación de la concentración de azúcares reductores

• Aspergillus niger a concentración de 30g/L

Biomasa [30gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.158)*(1-exp(k*tiempo))))

k = 0.9509181

137
• Aspergillus niger a concentración de 40g/L

Biomasa [40gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/14.342)*(1-exp(k*tiempo))))

k = 1.4580631

• Aspergillus niger a concentración de 50g/L

Biomasa [50gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/28.522)*(1-exp(k*tiempo))))

k = 1.4753353

138
• Aspergillus niger medio de Control

Biomasa Control = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.4)*(1-exp(k*tiempo))))

k = 0.6402406

T. harzianum variación de la concentración de azúcares reductores

• Trichoderma harzianum a concentración de 30g/L

Biomasa [30gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/12.396)*(1-exp(k*Tiempo))))

k = 0.8190618

139
• Trichoderma harzianum a concentración de 40g/L

Biomasa [40gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/11.412)*(1-exp(k*Tiempo))))

k = 1.1414981

• Trichoderma harzianum a concentración de 50g/L

Biomasa [50gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/29.016)*(1-exp(k*Tiempo))))

k = 0.6289445

140
• Trichoderma harzianum medio de Control

Biomsa Control = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/10.634)*(1-exp(k*Tiempo))))

k = 0.4885395

141