ANEXO 1 Conteo en cámara de Neubauer. Esta cámara se utiliza para conteo celular.

• • • • Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedar centrada. Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. • La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del recuadro. Conteo: Lleve la cámara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de 4X. Observará lo siguiente.

122

Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la siguiente manera:

En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la

123

que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales células son contables o cuales están fuera del campo de conteo. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan el cuadro. Gráficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo.cuadricula hasta contar en todos los cuadros. 124 . si la tocan o están encima de ella no se incluyen. Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no que no se cuenten. Las células que no tocan la segunda línea son contables. Las células que tiene una X son las que no se deben contar. Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera: • Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. El conteo en estos campos de la cámara de conoce como AP (alto poder).

el espacio ocupado por el líquido en el que están las células que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla de cuarzo. este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a desarrollarse el microorganismo. • Se promedia el número de esporas de la cámara de arriba con la de abajo.: 1*108 esporas) Luego. Para esto se utiliza el área de cada cuadro. obteniendo el valor X. 125 . esta cantidad se aproxima y se expresa en ul.• Después de contar las células se procede a calcular la el numero de células por unidad de volumen. Si 1ml del preinoculo ? ____________ X esporas ____________ Esporas a inocular (Ej. se multiplica por el factor de dilución y por un factor F igual a106 si se contó el cuadro central o 104 si se contaron los cuadros de los extremos.

Leer a 540 nm.5 mL de reactivo DNS.25. 2 y 4.ANEXO 2 Método del Ácido Dinitrosalicílico (DNS) Pasos para preparar DNS: • • • • • Disolver 1. 1. Enfriar con hielo.6 g de NaOH en H2O destilada.5 mL de cada dilución y agregar 0. Adicionar 30 g de tartrato de Na y K Adicionar 1 g de DNS Aforar a 100 mL con H2O destilada Almacenar en frascos ámbar a 4 ºC Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 ºC.5. Adicionar 5 mL de H2O destilada. Preparar una muestra blanco por dilución de 0. 0. Procedimiento: • • • • • • • • Tomar 0. Agitar y dejar en reposo 15 min.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL del reactivo de DNS. Agitar todas las muestras. A partir de la solución de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrón con la siguientes concentraciones (g/L): 0. Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos. 126 .

991 a 0. Debe tener un coeficiente de correlación de 0. 0. Método de DNS 127 .5 ml DNS Ebullición de muestra 5min Enfriar con hielo 0.999.5ml agua destilada Agitar y reposar 15min Leer Absorbancia λ= 540nm Figura 14.• Realizar la curva Absorbancia versus concentración.5ml muestra problema + 0.

9% (P/V). Se aplica el mismo procedimiento que a las demás muestras.2.5 mL de las soluciones patrón de albúmina.5 mL de NaOH 2N y llevar al baño María precalentado a 100°C por un tiempo de 10 minutos. Adicionar 0. Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos. las muestras problema y NaCl al 0. Deben estar marcados para conservar el orden de concentraciones para la curva.ANEXO 3 Método de Lowry Para obtener la curva estándar de Albúmina se preparan 5 soluciones patrones de Albúmina en NaCl al 0. 80.9% (P/V) de las siguientes concentraciones: 15. Concentración de albúmina sérica de bovina (BSA). con esta se puede determinar la concentración de las muestras problema interpolando el valor 128 . si está entre 1000 y 2000 µg/mL se lee a 550 nm. Si la concentración de Proteína es menor de 500 µg/mL se lee la absorbancia a 750 nm. Agregar a cada tubo 5 mL de la solución complejante.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu 1:1. mezclar y dejar reposar por 10 minutos. Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patrón construir la gráfica Absorbancia vs. • • • • • Adicionar a cada tubo 0.5 mL de solución salina (NaCl) al 0. 200. Se prepara un blanco que no lleva Albúmina y en su reemplazo se adicionan 0. 300 y 400 µg/mL.9% como blanco. Procedimiento: • Servir en tubos de ensayo 0. vortexiar durante 20 segundos. Dejar enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente.

La curva estándar debe tener un coeficiente de correlación (r) de 0. Método de Lowry 129 . Ambiente 0. 4.991 a 0. Figura 15.5ml de NaOH 2N Adicionar Calentar 100ºC 10min.5ml de solución l j t Mezclar y agitar 0. 2.de absorbancia.5ml de Reactivo Reposar 10 min. Mezclar en vórtex 20 Leer absorbancia Graficar Absorbancia Vs. Enfriar a Tem. Preparar tubos 1.5 y blanco 0.999. 3.

85077 3 418. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 1255.069663 36 20. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato en el crecimiento de A.2805993 Total 2676.86626545 Dentro de los grupos 725.34637 44 32.616924 12. niger. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 124.12229449 2.ANEXO 4 Tablas ANOVA Este es el análisis estadístico de las tablas ANOVA para el crecimiento microbiano de microorganismos.75427 39 Tabla 36.81646351 Dentro de los grupos 1420. Tabla 35.140824 Total 849.344E-06 2.19714 47 130 .5615357 2.9680654 3.06354694 0. Análisis de varianza efecto de pH de extracción sobre el crecimiento de A.684607 3 41. niger. variando el pH de extracción del Higo y la concentración de nutrientes.

0164E-06 2.40189872 3 0.935449 3 36.013558 39 Tabla 38.078109 36 9.0302319 7.7962027 32 0. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de Suma de Grados de Promedio de las variaciones cuadrados libertad los cuadrados Entre grupos 0. Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.81646351 Dentro de los grupos 1183.99485 44 26.Tabla 37.13396624 Dentro de los grupos 18.15843 47 Tabla 39.87615582 2. Análisis de varianza de la incidencia del pH de extracción en el comportamiento del Trichoderma harzianum ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 108.3118164 4.58738133 Total 19.163585 3 323.1981014 35 F Probabilidad Valor crítico para F 0.86626545 Dentro de los grupos 325.02126552 0.90111757 131 .721195 12.22807371 0.01446703 2.9089738 Total 2155.02994747 Total 434. Análisis de varianza de la incidencia de la concentración en el crecimiento del Trichoderma harzianum ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico F Probabilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F Entre grupos 971.

05891499 Dentro de los grupos 12.17674497 3 0. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.86626545 Dentro de los grupos 10.3995633 Total 12.40807414 2.89247125 3 0.Tabla 40.7860256 32 0.30023635 Total 11.90111757 Tabla 42.86626545 Dentro de los grupos 11.16272894 0.187442 36 0. Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimiento de Rhodotorula.31076228 Total 15. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre el crecimiento de Rhodotorula.88085737 3 1.29361912 4.14744845 0.0682993 39 132 . ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de variaciones cuadrados libertad los cuadrados Entre grupos 0.01248242 2.9627706 35 Valor crítico F Probabilidad para F 0.29749042 0. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico F Probabilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F Entre grupos 3.93056632 2. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 0.8085088 36 0.99085408 0.70098 39 Tabla 41.

ANEXO 5 Constante K con el programa Polymath Se utilizó el programa Polymath para hallar los valores de las constantes de K Aspergillus niger variación del pH de extracción • Aspergillus niger a pH de extracción 2 BiomasapH2 = (0.96/14.786)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.333 133 .96*exp(k*tiempo))/(1-((0.

2194934 134 .334)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.3556933 • Aspergillus niger a pH de extracción 12 BiomasapH12 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.96/14.• Aspergillus niger a pH de extracción 7 BiomasapH7 = (0.96/18.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.

1203965 135 .96/13.45)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.1340424 Trichoderma harzianum variación del pH de extracción • Trichoderma harzianum a pH de extracción 2 BiomasapH2 = (1.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.574)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.• Aspergillus niger medio de Control Biomasa Control = (0.

6580878 136 .412)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.002/11.• Trichoderma harzianum a pH de extracción 7 BiomsapH7 = (1.154)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/17.2273364 • Trichoderma harzianum a pH de extracción 12 BiomasapH12 = (1.

• Trichoderma harzianum medio de Control BiomasaControl = (1.482/13.97329 A.648)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.428*exp(k*tiempo))/(1-((2. Niger variación de la concentración de azúcares reductores • Aspergillus niger a concentración de 30g/L Biomasa [30gr/L] = (2.002/9.9509181 137 .158)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.

522)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.4753353 138 .4580631 • Aspergillus niger a concentración de 50g/L Biomasa [50gr/L] = (2.482/28.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/14.• Aspergillus niger a concentración de 40g/L Biomasa [40gr/L] = (2.342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.

4)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.8190618 139 .21/12.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.6402406 T.396)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.• Aspergillus niger medio de Control Biomasa Control = (2.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3. harzianum variación de la concentración de azúcares reductores • Trichoderma harzianum a concentración de 30g/L Biomasa [30gr/L] = (3.482/13.

21/11.• Trichoderma harzianum a concentración de 40g/L Biomasa [40gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.016)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.6289445 140 .1414981 • Trichoderma harzianum a concentración de 50g/L Biomasa [50gr/L] = (3.21/29.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.412)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 1.

4885395 141 .21/10.• Trichoderma harzianum medio de Control Biomsa Control = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.634)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.