ANEXO 1 Conteo en cámara de Neubauer. Esta cámara se utiliza para conteo celular.

• • • • Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol. Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada. Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe quedar centrada. Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la distribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser continuo en un solo intento. • La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del recuadro. Conteo: Lleve la cámara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el ocular de 4X. Observará lo siguiente.

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Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias, etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizará de la siguiente manera:

En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio. Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la

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Se recomienda realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células dos veces o no que no se cuenten. 124 . Las células que tiene una X son las que no se deben contar. El conteo en estos campos de la cámara de conoce como AP (alto poder). Las células que no tocan la segunda línea son contables. Alrededor de cada cuadricula se observa que hay tres líneas que delimitan el cuadro. Con el lente de 40X cada cuadro se ve de la siguiente manera: • Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Gráficamente se puede apreciar la forma correcta de conteo. si la tocan o están encima de ella no se incluyen. que son fundamentales en el momento del conteo ya que definen cuales células son contables o cuales están fuera del campo de conteo.cuadricula hasta contar en todos los cuadros.

se multiplica por el factor de dilución y por un factor F igual a106 si se contó el cuadro central o 104 si se contaron los cuadros de los extremos. Para esto se utiliza el área de cada cuadro.: 1*108 esporas) Luego. obteniendo el valor X. • Se promedia el número de esporas de la cámara de arriba con la de abajo.• Después de contar las células se procede a calcular la el numero de células por unidad de volumen. 125 . esta cantidad se aproxima y se expresa en ul. el espacio ocupado por el líquido en el que están las células que es el mismo espacio que hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla de cuarzo. Si 1ml del preinoculo ? ____________ X esporas ____________ Esporas a inocular (Ej. este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a desarrollarse el microorganismo.

Agitar todas las muestras. Adicionar 5 mL de H2O destilada.5 mL de reactivo DNS.5. 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL del reactivo de DNS. Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos. 1.ANEXO 2 Método del Ácido Dinitrosalicílico (DNS) Pasos para preparar DNS: • • • • • Disolver 1. Agitar y dejar en reposo 15 min. 2 y 4. A partir de la solución de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrón con la siguientes concentraciones (g/L): 0. Procedimiento: • • • • • • • • Tomar 0. Adicionar 30 g de tartrato de Na y K Adicionar 1 g de DNS Aforar a 100 mL con H2O destilada Almacenar en frascos ámbar a 4 ºC Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 ºC. Preparar una muestra blanco por dilución de 0. Leer a 540 nm.6 g de NaOH en H2O destilada.5 mL de cada dilución y agregar 0. 126 . Enfriar con hielo.25.

0.5ml agua destilada Agitar y reposar 15min Leer Absorbancia λ= 540nm Figura 14. Método de DNS 127 .5 ml DNS Ebullición de muestra 5min Enfriar con hielo 0.• Realizar la curva Absorbancia versus concentración. Debe tener un coeficiente de correlación de 0.991 a 0.999.5ml muestra problema + 0.

Adicionar 0.9% (P/V) de las siguientes concentraciones: 15.5 mL de las soluciones patrón de albúmina.ANEXO 3 Método de Lowry Para obtener la curva estándar de Albúmina se preparan 5 soluciones patrones de Albúmina en NaCl al 0. Concentración de albúmina sérica de bovina (BSA). Agregar a cada tubo 5 mL de la solución complejante. si está entre 1000 y 2000 µg/mL se lee a 550 nm.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu 1:1. Si la concentración de Proteína es menor de 500 µg/mL se lee la absorbancia a 750 nm. Procedimiento: • Servir en tubos de ensayo 0. Se aplica el mismo procedimiento que a las demás muestras.9% (P/V).2. Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patrón construir la gráfica Absorbancia vs. mezclar y dejar reposar por 10 minutos. 80.9% como blanco. vortexiar durante 20 segundos. • • • • • Adicionar a cada tubo 0. Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos. Se prepara un blanco que no lleva Albúmina y en su reemplazo se adicionan 0. con esta se puede determinar la concentración de las muestras problema interpolando el valor 128 . las muestras problema y NaCl al 0. Dejar enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente.5 mL de solución salina (NaCl) al 0. Deben estar marcados para conservar el orden de concentraciones para la curva.5 mL de NaOH 2N y llevar al baño María precalentado a 100°C por un tiempo de 10 minutos. 200. 300 y 400 µg/mL.

Método de Lowry 129 .991 a 0. 2. Preparar tubos 1.5 y blanco 0.5ml de solución l j t Mezclar y agitar 0. Enfriar a Tem.5ml de Reactivo Reposar 10 min. La curva estándar debe tener un coeficiente de correlación (r) de 0. Figura 15. 4.5ml de NaOH 2N Adicionar Calentar 100ºC 10min. Mezclar en vórtex 20 Leer absorbancia Graficar Absorbancia Vs.de absorbancia. 3.999. Ambiente 0.

niger.616924 12.2805993 Total 2676. Tabla 35.34637 44 32. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 124.684607 3 41. niger.5615357 2.86626545 Dentro de los grupos 725.ANEXO 4 Tablas ANOVA Este es el análisis estadístico de las tablas ANOVA para el crecimiento microbiano de microorganismos.19714 47 130 .069663 36 20.85077 3 418.140824 Total 849.12229449 2. Análisis de varianza efecto de pH de extracción sobre el crecimiento de A. variando el pH de extracción del Higo y la concentración de nutrientes.344E-06 2.81646351 Dentro de los grupos 1420.9680654 3. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 1255. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato en el crecimiento de A.75427 39 Tabla 36.06354694 0.

3118164 4.721195 12.935449 3 36. Análisis de varianza de la incidencia de la concentración en el crecimiento del Trichoderma harzianum ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico F Probabilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F Entre grupos 971.Tabla 37. Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.9089738 Total 2155. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de Suma de Grados de Promedio de las variaciones cuadrados libertad los cuadrados Entre grupos 0.13396624 Dentro de los grupos 18.163585 3 323.0164E-06 2.86626545 Dentro de los grupos 325.013558 39 Tabla 38.02126552 0.40189872 3 0. Análisis de varianza de la incidencia del pH de extracción en el comportamiento del Trichoderma harzianum ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 108.15843 47 Tabla 39.58738133 Total 19.0302319 7.81646351 Dentro de los grupos 1183.1981014 35 F Probabilidad Valor crítico para F 0.01446703 2.02994747 Total 434.87615582 2.22807371 0.7962027 32 0.90111757 131 .99485 44 26.078109 36 9.

Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimiento de Rhodotorula.86626545 Dentro de los grupos 10.70098 39 Tabla 41.7860256 32 0.93056632 2.89247125 3 0.29361912 4.17674497 3 0. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae.9627706 35 Valor crítico F Probabilidad para F 0.14744845 0.88085737 3 1.40807414 2.99085408 0.05891499 Dentro de los grupos 12.16272894 0. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico F Probabilidad variaciones cuadrados libertad los cuadrados para F Entre grupos 3.30023635 Total 11.3995633 Total 12.86626545 Dentro de los grupos 11.31076228 Total 15.Tabla 40. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de Valor crítico variaciones cuadrados libertad los cuadrados F Probabilidad para F Entre grupos 0.8085088 36 0. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre el crecimiento de Rhodotorula.0682993 39 132 .29749042 0.01248242 2.90111757 Tabla 42. ANÁLISIS DE VARIANZA Origen de las Suma de Grados de Promedio de variaciones cuadrados libertad los cuadrados Entre grupos 0.187442 36 0.

96*exp(k*tiempo))/(1-((0.ANEXO 5 Constante K con el programa Polymath Se utilizó el programa Polymath para hallar los valores de las constantes de K Aspergillus niger variación del pH de extracción • Aspergillus niger a pH de extracción 2 BiomasapH2 = (0.96/14.333 133 .786)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.

334)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.3556933 • Aspergillus niger a pH de extracción 12 BiomasapH12 = (0.342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/18.• Aspergillus niger a pH de extracción 7 BiomasapH7 = (0.2194934 134 .

• Aspergillus niger medio de Control Biomasa Control = (0.1340424 Trichoderma harzianum variación del pH de extracción • Trichoderma harzianum a pH de extracción 2 BiomasapH2 = (1.1203965 135 .574)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/13.45)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.002/9.

154)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/17.2273364 • Trichoderma harzianum a pH de extracción 12 BiomasapH12 = (1.6580878 136 .002*exp(k*tiempo))/(1-((1.• Trichoderma harzianum a pH de extracción 7 BiomsapH7 = (1.002/11.412)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 2.

648)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.482/13.002/9.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.158)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0. Niger variación de la concentración de azúcares reductores • Aspergillus niger a concentración de 30g/L Biomasa [30gr/L] = (2.• Trichoderma harzianum medio de Control BiomasaControl = (1.97329 A.9509181 137 .002*exp(k*tiempo))/(1-((1.

482/14.482/28.4753353 138 .• Aspergillus niger a concentración de 40g/L Biomasa [40gr/L] = (2.4580631 • Aspergillus niger a concentración de 50g/L Biomasa [50gr/L] = (2.522)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.342)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 1.

396)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.482/13.21/12.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.• Aspergillus niger medio de Control Biomasa Control = (2.8190618 139 .6402406 T.428*exp(k*tiempo))/(1-((2. harzianum variación de la concentración de azúcares reductores • Trichoderma harzianum a concentración de 30g/L Biomasa [30gr/L] = (3.4)*(1-exp(k*tiempo)))) k = 0.

• Trichoderma harzianum a concentración de 40g/L Biomasa [40gr/L] = (3.6289445 140 .21/11.21/29.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.1414981 • Trichoderma harzianum a concentración de 50g/L Biomasa [50gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.412)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 1.016)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.

21/10.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.4885395 141 .• Trichoderma harzianum medio de Control Biomsa Control = (3.634)*(1-exp(k*Tiempo)))) k = 0.

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