PLAN DE VERIFICACIÓN O VALIDACIÓN DE

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MÉTODOS

PLAN DE IMPLEMENTACIÓN Y VALIDACIÓN PARA LA DETECCIÓN DEL Virus

de la Necrosis Pancreática Infecciosa (VNPI), Yersinia ruckeri, Aeromonas
salmonicida y Flavobacterium psychrophilum MEDIANTE PCR EN TIEMPO
REAL EN TEJIDO DE TRUCHA ARCOIRIS

VERIFICACIÓN ☐ VALIDACIÓN ☒

1. OBJETIVO: IMPLEMENTAR Y VALIDAR LOS MÉTODOS DE DETECCIÓN DEL VIRUS

DE LA NECROSIS PANCREÁTICA INFECCIOSA (VNPI), Yersinia ruckeri, Aeromonas
salmonicida y Flavobacterium psychrophilum MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL Y /RT-
PCR EN TIEMPO REAL

2. ALCANCE: Compósito de tejidos de hígado, riñón y bazo preservados en etanol (96%).

Región abdominal de alevines preservada en etanol (96%).

3. Hospedero: Peces salmónidos (trucha arcoíris)

4. MÉTODO:

DETECCIÓN DEL VIRUS DE LA NECROSIS PANCREÁTICA INFECCIOSA (IPNV) EN

TRUCHA ARCOÍRIS.

DETECCIÓN DE Yersinia ruckeri, Aeromonas salmonicida y Flavobacterium psychrophilum

EN TRUCHA “ARCOÍRIS”.

5. DOCUMENTOS DE REFERENCIA:
• Tapia, D., Eissler, Y., Torres, P., Jorquera, E., Espinoza, J. C., & Kuznar, J. (2015).
Detection and phylogenetic analysis of infectious pancreatic necrosis virus in Chile.
Diseases of aquatic organisms, 116(3), 173-184.Se tomó la secuencia de primers y sondas
de dicho artículo para la detección de VNPI.
• Snow, M., McKay, P., McBeath, A. J., Black, J., Doig, F., Kerr, R., ... & Devold, M. (2006).
Development, application and validation of a Taqman real-time RT-PCR assay for the
detection of infectious salmon anaemia virus (ISAV) in Atlantic salmon (Salmo
salar). Developments in biologicals, 126, 133-45. Se tomó la secuencia de primers y sonda
de dicho artículo para la detección del gen ELF-1α.
• Keeling, S. E., Johnston, C., Wallis, R., Brosnahan, C. L., Gudkovs, N., & McDonald, W. L.
(2012). Development and validation of real‐time PCR for the detection of Yersinia
ruckeri. Journal of Fish Diseases, 35(2), 119-125. Se tomó la secuencia de primers y
sondas de dicho artículo para la detección de Yersinia ruckeri.
• Keeling, S. E., Brosnahan, C. L., Johnston, C., Wallis, R., Gudkovs, N., & McDonald, W. L.
(2013). Development and validation of a real‐time PCR assay for the detection of
Aeromonas salmonicida. Journal of Fish Diseases, 36(5), 495-503. Se tomó la secuencia
de primers y sondas de dicho artículo para la detección de Aeromonas salmonicida.
• Strepparava, N., Wahli, T., Segner, H., & Petrini, O. (2014). Detection and quantification of
Flavobacterium psychrophilum in water and fish tissue samples by quantitative real time
PCR. BMC microbiology, 14(1), 1-10. Se tomó la secuencia de primers y sondas de dicho
artículo para la detección de Flavobacterium psychrophilum.

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6. PRINCIPIO DEL MÉTODO: Detección de una secuencia del genoma de bacterias y/o
virus mediante PCR en tiempo real o RT-PCR en tiempo real de un paso con sondas
Taqman.

7. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:

7.1 EQUIPOS
- Equipo termociclador en tiempo real: Quant Studio 5.
- Estación automatizada de extracción Maxwell® RSC Instrument. Promega.
- Micropipetas: 0.5 - 10 µl, 2 - 20 µl, 10 - 100 µl, 20 - 200 µl y 100 - 1000 µl.
- Mini vortex.
- Centrífuga.
- Fluorómetro Qubit™ 4 Invitrogen.
- Espectrofotómetro de microplacas Epoch 2 BioTek.
- Termobloque.

7.2 MATERIALES
- Pestles.
- Microtubos de centrífuga de 1.5 mL.
- Tubos strips 0.2 mL para PCR en tiempo real.
- Tapas strips para PCR en tiempo real.
- Tips de baja retención con filtro y libre de nucleasas con medidas de: 0.5 - 10 µl, 2 -
20 µl, 10 - 100 µl, 20 - 200 µl y 100 - 1000 µl.
- Tubos de polipropileno para centrífuga de 50 mL.
- Tubos de polipropileno para centrífuga de 15 mL.

7.3 REACTIVOS
- ReliaPrep™ RNA Tissue Miniprep System. Promega Cod. Z6112 (columnas).
- Maxwell® RSC simplyRNA Tissue Kit. Promega Cod. AS1340 (perlas).
- PureLink™ Genomic DNA Mini Kit. Invitrogen Cod. Z6112 (columnas).
- Maxwell® RSC Tissue DNA Kit. Promega Cod. AS1610 (perlas).
- GoTaq® Probe qPCR and RT-qPCR Systems. Promega Cod. A6121.
- qScript® 1-Step Virus ToughMix®, Low ROXTM. Quantabio Cod. 95212-100.
- Primers y sonda para detección de VNPI, Yersinia ruckeri, Aeromonas salmonicida y
Flavobacterium psychrophilum.
- Primers y sonda para detección de ELF-1α.
- Material de referencia de VNPI,Yersinia ruckeri, Aeromonas salmonicida y
Flavobacterium psychrophilum.
- Material genético estándar de VNPI, Yersinia ruckeri, Aeromonas salmonicida y
Flavobacterium psychrophilum.
- Qubit™ RNA High Sensitivity (HS). Invitrogen.
- Qubit™ RNA Broad-Range (BR). Invitrogen.
- Qubit™ DNA Broad-Range (BR). Invitrogen.
- Agua libre de nucleasas.
- Etanol absoluto.
- Alcohol isopropílico.

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8. PARÁMETROS ESTADÍSTICOS A REALIZAR:

• VERACIDAD ☒ • INCERTIDUMBRE ☐

• PRECISIÓN (REPET / REPROD) ☒ • ROBUSTEZ ☐

• LÍMITE DE DETECCIÓN ☒ • SENSIBILIDAD ☒

• LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN ☐ • SELECTIVIDAD / ESPECIFICIDAD ☒

• OTROS ☐

9. EQUIPO DE TRABAJO:

10. FLUJOGRAMA: (Proceso detallado)

10.1 Implementación de los métodos de ensayo

Se evaluarán los parámetros de validación descritos a continuación para todos los
métodos considerados.

10.1.1 Linealidad y eficiencia de la PCR

- Realizar diluciones seriadas a partir del material genético estándar de cada patógeno, las cuales
formarán parte de la curva estándar (5 réplicas por cada dilución): 106, 105, 104, 103, 102, 10
copias genómicas/reacción y 5 controles negativos.

- El análisis de la linealidad y eficiencia de la PCR será calculado por el software del

termociclador, determinando a su vez el umbral para la detección de cada patógeno con el
análisis en modo manual del resultado de la PCR en tiempo real.

- El umbral de amplificación deberá ser establecido de manera que éste cruce el área donde los
ploteos de amplificación (vista logarítmica) sean paralelos en la fase exponencial.

- Criterio de aceptación:
Eficiencia de la PCR: 90% - 100%
Coeficiente de determinación: >0.98

10.1.2 Eficiencia de extracción: cantidad y calidad del material genético

- Realizar la extracción de ARN o ADN total según corresponda con los kits declarados en el
punto 6.3: 10 muestras de trucha arcoíris en estado de conservación adecuado con cada kit de
extracción. Cada análisis comprende un peso de alrededor de 20 mg de tejido homogenizado.

- Criterios de aceptación de cantidad y calidad:

Criterio de aceptación de cantidad por lo menos 16 ng/ul (Qubit)
Criterio de aceptación de calidad: Pureza DO260/280 > 1.7 (Epoch2)

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10.1.3 Límite de detección analítico de la PCR con el estándar

Cuantificar en Qubit la concentración del estándar lineal y calcular el número de copias/ul.
Realizar las diluciones seriadas del estándar con un concentrado homogéneo de ADN de fondo
(hospedero) negativo para el patógeno blanco.
Realizar la PCR de las diluciones del estándar hasta 1 copia por reacción. 12 réplicas de cada
dilución: 1, 5, 10, 20, 100 copias por reacción. 3 réplicas de controles negativos.

10.1.4 Determinación del umbral del control endógeno (ELF-1α)

A partir de los extraídos obtenidos en el punto 10.1.2 se determina el umbral del control endógeno
analizando en modo manual el resultado de la PCR en tiempo real.
El umbral de amplificación deberá ser establecido de manera que éste cruce el área donde los
ploteos de amplificación (vista logarítmica) sean paralelos en la fase exponencial, tomando como
referencia que los CT obtenidos del gen ELF-1α deben ser menor a 34.

10.1.5 Evaluación de la inhibición de la PCR

A partir de los extraídos obtenidos en el punto 10.1.2 se evalúa por duplicado la inhibición de la
PCR comparando las siguientes mezclas de PCR:
- Se inocula 5 ul de extraído más 1 ul de estándar del patógeno (105 copias /ul) en 20 ul de master
mix.
- Se inocula adicionalmente 5 ul de agua libre de nucleasas + 1 ul de estándar del patógeno.
- Se inocula 5 ul del extraído (diluido 1/10) más 1 ul de estándar del patógeno (105 copias /ul) en
20 ul de master mix. Se inocula adicionalmente 5 ul de agua libre de nucleasas + 1 ul de estándar
del patógeno.

Criterio de evaluación de la inhibición de la PCR ∆Ct <2 (CE: 10 5 copias genómicas/ul),

repetibilidad (∆Ct <1).

10.2 Evaluación de parámetros de validación: sensibilidad, especificidad,

precisión y veracidad

10.2.1 Muestras biológicas

-Muestra compositada de tejido (bazo, hígado y riñón) de trucha arcoíris preservada en etanol al
96% a -20 ºC. Se homogenizan las muestras compositadas en microtubos indepedientes en
cantidades de 800 mg y 240 mg.

-Se procede a pesar las cantidades necesarias para ser inoculadas según el nivel de inoculación
indicado en el siguiente párrafo.

-Se inoculará material de referencia según el patógeno a evaluar en tejido libre del patógeno de
trucha arcoíris con el propósito de obtener 4 niveles: 100 copias genómicas/mg (4 réplicas), 50
copias genómicas/mg (4 réplicas), 20 copias genómicas/mg (10 réplicas) ,10 copias
genómicas/mg (12 réplicas). Se empleará 1 control negativo de extracción.

- Cada análisis comprende un peso de alrededor de 20 mg de tejido homogenizado.

10.2.2 Extracción de ARN total

-Realizar la extracción de ARN total con el Kit ReliaPrep™ RNA Tissue Miniprep System y el kit
Maxwell® RSC simplyRNA Tissue Kit. Cada kit de extracción debe evaluarse de acuerdo a 10.2.1,
por lo tanto, cada analista evaluará 15 muestras positivas y 4 muestras negativas por kit.

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10.2.3 Detección por RT-PCR en tiempo real

La mezcla de reactivos de cada kit de PCR se realiza de acuerdo a las instrucciones de cada
fabricante.

Las condiciones de PCR considerarán las tiempos y temperatura de cada etapa establecida por
el fabricante de tal manera que se adecue a los tiempos y temperatura de hibridación y
amplificación correspondiente a cada juego de primers y sondas, así mismo sus concentraciones
según recomendación de las referencias de los patógenos.

10.2.4 Eficiencia de recuperación.

Cuantificar la recuperación de las muestras inoculadas con material de referencia de cada
patógeno del 10.2.1 mediante una curva estándar y establecer la eficiencia de recuperación
comparando con la carga viral esperada de acuerdo al inóculo.

10.2.5 Evaluación estadística

La evaluación estadística se realizará según las indicaciones contenidas en el manual de la OIE,
Capítulo 1.1.2 Principios y métodos de validación de las pruebas de diagnóstico de las
enfermedades infecciosas, en el Manual de pruebas de diagnóstico para los animales acuáticos
2021.

10.3 Informe de validación

Se elaborará un informe que incluya los resultados de la implementación y la evaluación
estadística de los parámetros de validación considerados.

11. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES:

Actividad Ago Set Oct

(30%) (35%) (35%)
10.1 Implementación de los
métodos de ensayo
-Linealidad y eficiencia de la X X
PCR. -
Eficiencia de extracción: cantidad y
calidad de material genético.
-Evaluación de la inhibición de la
PCR.

-Límite de detección analítico de la X X

PCR con el estándar.
-Determinación del umbral del
control endógeno (ELF-1α)
10.2 Evaluación de parámetros de X X
validación: sensibilidad,
especificidad, precisión y
veracidad.

10.3 Informe de validación X

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