QUE PASA DENTRO DEL TERMOCICLADOR

El termociclador es la máquina con la que se llevan a cabos las PCRs. Primero se preparan las
muestras de ADN o ARN que van a ser amplificadas, son purificadas y mezcladas con los reactivos
necesarios para llevar a cabo la PCR. En ese momento los tubos, de unos 150 microL, ya están preparados
para ser introducidos en el termociclador para la amplificación.
Tradicionalmente, se lleva a cabo la amplificación de una cadena de bases nitrogenadas en tres
pasos.
Antes de empezar los ciclos de amplificación se realiza un paso previo. En él se ponen las
muestras a una temperatura superior a 90 grados centígrados, normalmente a 94 – 98ºC, de esta manera
las dos hebras que componen la cadena nitrogenada, ADN o ARN, se separan y además
se deshace cualquier conformación secundaria que haya adquirido el ADN, circularizaciones o
emparejamiento de una hebra consigo misma. Este paso tiene una duración grande para asegurar la
separación de todos los motivos que se hayan podido formar, entre 30 segundos y 2 minutos.

Ciclos de amplificación:
El primer paso vuelve a ser un paso de desnaturalización, que si bien en el primer ciclo no es
muy importante en los ciclos siguientes separará las hebras que se hayan formado. Este paso suele hacerse
también a una temperatura alta, 94 o 98 ºC y dura más o menos diez segundos.
El segundo paso es la alineación de los oligos o primers en la hebra molde que queremos
amplificar. Este paso dura unos 20 segundos y se lleva a cabo a una temperatura variable, puesto que
depende de la secuencia de los primers que se usan. En inglés este paso se llama annealing, y muchas
veces se traduce demasiado literalmente como anillado.
Los primers son las pequeñas secuencias de unos 20 nucleótidos que hemos comprado o fabricado
que se unirán a la secuencia que queramos amplificar. Los primers reconocen la secuencia de nuestro gen
de interés, se pegan a ella por apareamiento de bases homólogas y mediante la actividad de la elongación
de la polimerasa se copia el gen. Los primers suelen utilizarse en parejas, uno para copiar la hebra
positiva y el otro la negativa.
Como decíamos la temperatura de este paso es variable, dependiendo de los primers. El fabricante
que los facilita suele añadir algunos datos sobre los oligos. Como el porcentaje de GC o la “Tm”,
temperatura de melting, a la que teóricamente la mitad de las hebras están formando cadenas sencillas,
es decir, es la temperatura a la que con seguridad los primers no tienen configuraciones secundarias. Por
eso se emplea una temperatura un poco superior a la Tm para este paso, que muchas veces es una
temperatura que ronda entre los 55ºC y los 65ºC hasta los
72ºC.
El tercer paso es, lógicamente, la elongación de la
doble hebra de 20 pares de bases creada en el paso anterior,
para ello se usa una temperatura de unos 72ºC, que es la
temperatura óptima de trabajo de la Taq polimerasa y de
otras polimerasas, aunque las polimerasas suelen ir
acompañadas de las especificaciones de uso donde lo pone. La
elongación tiene un tiempo variable, siendo aconsejable
un minuto por kilobase, mil bases, del gen que queramos
amplificar y la Taq se recomienda para secuencias cortas de
hasta 4 Kb máximo, puesto que a partir de ese punto pierde la
eficacia.
Tras este paso lo más frecuente es volver al primer
paso de 98ºC durante 10 segundos y repetir el ciclo entre 30
y 45 veces.
Al final de los ciclos se suele añadir un paso de calor, 72ºC durante unos 7 minutos para separar
las hebras del ADN de la polimerasa y de los primers. Después de deja en un paso de frio, de entre 15
y 4ºC con tiempo infinito, para mantener la muestra en buen estado hasta que se vaya a recoger.