Alen Zimic Sheen

Belén Balta Blanco

PRÁCTICA 9: Cuantificación viral por qPCR

Detección de Adenovirus F 40/41

Introducción

La carga viral, representativa de la cantidad de virus en un individuo, es un indicador crucial de la severidad de

las enfermedades virales y de la eficacia del tratamiento (Konrad, 2016; Perelson et al., 1996). Una técnica
relevante en este contexto es la Reacción en Cadena de la Polimerasa Cuantitativa (qPCR), la cual se diferencia
de la PCR convencional por su habilidad para cuantificar en tiempo real el producto de amplificación, haciendo
uso de un agente intercalante EvaGreen, el cual se une al ADN de doble cadena, y al hacerlo, emite
fluorescencia. La intensidad de esta fluorescencia aumenta significativamente cuando se une al ADN, lo que
permite la detección y cuantificación del producto de la PCR en tiempo real (Bustin et al., 2009).

Este estudio se centrará en la determinación de la carga viral del adenovirus humano (AdV), un virus sin
envoltura que contiene genoma de DNA de doble cadena (de 34 a 36 kb de tamaño). La mayoría de infecciones
se producen en niños, aunque los adultos inmunosuprimidos también tienen riesgo de infección o reactivación
en el tracto respiratorio, tracto intestinal y conjuntiva. La progresión de la enfermedad en poblaciones
inmunodeprimidas puede ser grave y tener efectos devastadores, con el consiguiente aumento de morbilidad y
mortalidad (Hijano et al., 2023). Existen más de 70 tipos de AdV, de los cuales algunos han sido asociados con
diferentes presentaciones clínicas. Por ejemplo, los tipos 40 y 41 (grupo F) se han implicado como causa
principal de gastroenteritis aguda (Starr et al., 2019). La qPCR ofrece un medio factible para el diagnóstico de
enfermedades causadas por tales virus, al detectar y amplificar su material genético (Gu et al., 2003).

Una métrica esencial en la qPCR es el Ciclo umbral o Cq, que es el punto durante la PCR donde la fluorescencia
del producto de amplificación supera un umbral preestablecido. La carga viral (número de copias del virus) se
correlaciona estrechamente con el Cq, aunque esta relación puede variar en función del blanco de amplificación
(Bustin et al., 2009). A mayor Cq necesarios para poder sobrepasar el threshold, significa que existe una menor
carga viral inicial, por lo cual la severidad de la infección debería ser relativamente menor a una con alta carga
viral.Esta práctica se enfocará en el estudio y comprensión detallada de la técnica de qPCR, su papel en la
determinación de la carga viral y su aplicabilidad en el estudio de patógenos como el AdV F 40/41.

Objetivos

● Graficar la relación entre el ciclo de cuantificación (Cq) y la concentración logarítmica de ADN

(log[DNA]) para establecer una curva estándar que permita la cuantificación de la carga viral.
● Utilizar la técnica de qPCR para determinar la carga viral de las muestras clínicas, basándose en la
curva estándar establecida.

Resultados

Tabla N°1: Datos de [DNA] y promedios de Cq de muestra estándar Mesa 2

Factor dilución [DNA] log[DNA] Cq

1:100000 0,0002 -3,698970004 30,878
1:10000 0,002 -2,698970004 29,090
1:1000 0,02 -1,698970004 28,756
1:100 0,2 -0,6989700043 26,380
1:10 2 0,3010299957 22,305
Gráfico N°1: Cq vs concentración de DNA de muestras estándar de la Mesa 2. A mayor Cq menor carga viral

Tabla N°2: Datos de [DNA] y promedios de Cq de muestra estándar Mesa 3

Factor dilución [DNA] log[DNA] Cq

1:100000 0,0002 -3,698970004 41,109
1:10000 0,002 -2,698970004 35,844
1:1000 0,02 -1,698970004 30,788
1:100 0,2 -0,6989700043 26,041
1:10 2 0,3010299957 23,663

Gráfico N°2: Cq vs concentración de DNA de muestras estándar de la Mesa 3. A mayor Cq menor carga viral
 Tabla N°3: Carga viral de muestras clínicas hipotéticas

Ecuación del patrón → y = -1,99x + 24,1

Eficiencia: 10^[-1/-1,99]-1 = 2,18 = 218%

Código de muestra Cq log[DNA] [DNA] (𝑛𝑔/µ𝐿)

M2_01 24,8 -0,35 0, 45

M2_02 29,3 -2,61 2, 44 × 10

−3

Ecuación del patrón → y = -4,47x + 23,9

Eficiencia: 10^[-1/-4,47]-1 = 0,67 = 67%

C Cq log[DNA] [DNA] (𝑛𝑔/µ𝐿)

Código de muestra

M3_01 24,3 -0,090 0, 81

M3_02 36,8 -2,89 1, 30 × 10

−3

Ejemplo de procedimiento de la muestra M2_01:

𝑦 =− 1, 99𝑥 + 24, 1
24, 8 =− 1, 99𝑥 + 24, 1
0, 7 =− 1, 99𝑥
𝑥 =− 0, 35 = 𝑙𝑜𝑔[𝐷𝑁𝐴]

− 0, 35 = 𝑙𝑜𝑔[𝐷𝑁𝐴]
−0,35
[𝐷𝑁𝐴] = 10 = 0, 45 𝑛𝑔/µ𝐿

Discusión

Los valores R2 de la regresión lineal de ambas gráficas se encuentran en el rango 0, 9 < 𝑥 < 1, lo cual
significa que el modelo explica gran parte de la variabilidad de los datos observados. En otras palabras, gran
proporción de la variabilidad de los valores de Cq es explicada por la variabilidad de la carga viral. No obstante,
las eficiencias obtenidas de 218% para la Mesa 2 y 67% para la Mesa 3 no se encuentran dentro del rango
óptimo de eficiencia para qPCR, el cual recae entre 80-110% (ThermoFisher, 2021). La baja eficiencia de la
Mesa 3 sugiere que hubo inhibidores de PCR, actividad ineficiente de la enzima o pipeteado inadecuado. Por
otro lado, una eficiencia arriba del 150% de la Mesa 2 podría indicar formación de dímeros o amplificación de
productos no específicos (BioSistemika, 2017). Las Mesas 1, 4, 5 y 6 no obtuvieron resultados cuantificables de
qPCR, posiblemente debido a errores en las diluciones del master mix y/o contaminación durante el pipeteado.

Al generar una curva estándar con concentraciones de ADN (𝑛𝑔/µ𝐿) conocidas, puede establecerse la relación
entre la concentración de ADN y el valor Cq, lo que permite la cuantificación de muestras desconocidas en
función de sus valores Cq en experimentos de qPCR. Es conveniente utilizar la cuantificación absoluta, lo cual
permite determinar si el paciente resulta positivo o negativo tras construir una curva estándar y calcular la carga
viral.
−3
Las muestras con mayor y menor carga viral son M3_01 (0,81 𝑛𝑔/µ𝐿) y M3_02 (1, 30 × 10 𝑛𝑔/µ𝐿),
respectivamente. Según un estudio de Hijano et al. sobre la correlación clínica de la carga viral de AdV en el
tracto respiratorio de niños inmunocomprometidos, el análisis de la curva ROC determinó que una carga de
ARN viral >7 log10 copias/mL predecía necesidad de ventilación mecánica. Una mayor carga adenoviral
respiratoria se asoció significativamente con un mayor riesgo de ventilación mecánica, mortalidad por todas las
causas y mortalidad atribuible a adenovirus (Hijano et al., 2023).
Como se observa en las gráficas lineales estándar, a mayor concentración de DNA (carga viral), menor es el
ciclo de cuantificación puesto que se necesitan menos ciclos de amplificación para que la señal de fluorescencia
alcance un nivel de detección. Aquellas muestras clínicas que tienen altas concentraciones iniciales de DNA, la
amplificación alcanza antes el umbral detectable (valor de Cq más bajo) porque hay más DNA molde
disponible, mientras que muestras con carga viral inicial baja requieren de más ciclos de amplificación antes de
alcanzar el umbral de detección (Cq más alto). Asimismo, si la carga viral aumenta, la sintomatología se agrava,
mientras que a menor carga viral la sintomatología será leve o ausente.

Conclusiones

2
● Se logró generar un patrón estándar Cq vs log[DNA] con un buen coeficiente de regresión (𝑅 ) cercano
a 1, lo cual refleja un buen ajuste de los datos. Sin embargo, las eficiencias (E) para las mismas no se
encuentran dentro del rango óptimo de 80-110%, lo cual sugiere que los resultados no son muy
confiables.
● La muestra M3_01 presenta la mayor carga viral (0, 81 𝑛𝑔/µ𝐿) y la muestra que presenta la menor
−3
carga viral es M3_02 (1, 30 × 10 𝑛𝑔/µ𝐿).

Cuestionario

1. ¿Qué componentes mínimos debe contener el 2x RT-PCR Buffer?

Un tampón de RT-PCR 2x generalmente contiene dNTPs (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), MgCl2 (un cofactor
necesario para la actividad de la polimerasa), sales de KCl y Tris-HCl para mantener la estabilidad del pH y la
integridad de la muestra durante la reacción, y finalmente estabilizadores y agentes quelantes para preservar la
actividad enzimática y evitar la contaminación por metales pesados (Mackay, 2004).

2. ¿Qué enzimas deberían estar contenidas en este ensayo?

Este ensayo debería contener principalmente dos enzimas: la transcriptasa inversa, que es responsable de
convertir el ARN viral en ADN complementario (cADN), y la polimerasa de ADN Taq, que se encarga de
amplificar el cADN en la etapa de PCR (Higuchi, Fockler, Dollinger, & Watson, 1993).

3. ¿Por qué es necesario cambiar de ambiente al momento de agregar el ADN?

El cambio de ambiente al agregar el ADN se hace principalmente para evitar la contaminación cruzada. La PCR
es una técnica altamente sensible y puede amplificar incluso pequeñas cantidades de ADN. Si las muestras o
reactivos se contaminan con ADN exógeno, puede llevar a resultados falsos positivos (Long, 1990).

4. Algunas polimerasas hot-start requieren una etapa inicial de incubación a alta temperatura
(90-95° C) ¿Por qué es necesaria esta etapa?

La etapa de incubación a alta temperatura (generalmente 95°C) se llama etapa de desnaturalización. El propósito
de esta etapa es desnaturalizar, es decir, separar, las dos hebras de ADN en hebras individuales para que los
cebadores y la polimerasa puedan interactuar con las hebras de ADN y comenzar el proceso de amplificación.
En el caso de las polimerasas hot-start, también sirve para activar la enzima, que está diseñada para empezar a
funcionar solo a altas temperaturas para evitar la amplificación no específica durante la preparación de la
reacción (Kellogg, Kwok, & Sninsky, 1994).

5. ¿En qué momento del programa de ciclado se producirá la fluorescencia?

La fluorescencia se producirá durante la etapa de extensión del programa de ciclado. Durante esta etapa, la
polimerasa de ADN se mueve a lo largo de la hebra de ADN molde, sintetizando una nueva hebra de ADN. En
el caso de la qPCR, un agente intercalante como SYBR Green o EvaGreen se une a las hebras de ADN de doble
cadena a medida que se forman y emite fluorescencia, que se mide en tiempo real para cuantificar la cantidad de
ADN producido (Wittwer, Herrmann, Moss, & Rasmussen, 1997).
Referencias:

1. Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M. & Wittwer, C. T. (2009).
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2. Perelson, A. S., Neumann, A. U., Markowitz, M., Leonard, J. M., & Ho, D. D. (1996). HIV-1 dynamics
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3. Mackay, I. M. (2004). Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clinical microbiology and
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13. Jeulin, H., Salmon, A., Bordigoni, P., & Venard, V. (2011). Diagnostic value of quantitative PCR for
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