Universidad​ ​Regional​ ​Amazónica​ ​IKIAM

Biología​ ​Molecular

Nombre:​ ​Oscar​ ​Enrique​ ​Lucas​ ​Solis

Título​ ​del​ ​artículo:

“PCR​ ​en​ ​tiempo​ ​real:​ ​una​ ​metodología​ ​para​ ​la​ ​detección​ ​y​ ​cuantificación​ ​de​ ​granulovirus.”

1.​ ​Resuma​ ​los​ ​hallazgos​ ​más​ ​importantes​ ​del​ ​artículo.

Se pudo desarrollar una técnica de PCR en tiempo real reproducible, sensible y específica, que
tenía aplicaciones en el estudio de la persistencia viral en campo, el control de infecciones en
crías de insectos y el control de la calidad de los bioplaguicidas hechos a base de
betabaculovirus. Esta técnica detecta betabaculovirus aislados de diferentes especies de insectos,
debido a la alta conservación de este gen dentro del género viral. Por lo tanto, es de gran utilidad
a la hora de utilizarlo para detectar y cuantificar granulovirus presentes en el tejido larval, suelo
y bioplaguicidas a base del mismo, ya que éste no necesita que las muestras que se analicen estén
purificados para poder ser cuantificados, debido a la sensibilidad y la especificidad que posee. En
la actualidad la determinación y cuantificación de granulovirus puede realizarse por técnicas
cualitativas o cuantitativas, pero ambas son poco específicas y poseen baja sensibilidad,
presentando limitaciones y es por este motivo que se desarrolla esta nueva técnica más sensible y
específica.

2. Describa la técnica de PCR en tiempo real empleada. Particularmente describa el

método​ ​de​ ​detección​ ​empleado​ ​y​ ​explique​ ​cómo​ ​funciona.

Para el método de detección se utilizó una sonda TaqMan diseñada sobre el gen de granulina, el cual
estaba altamente conservado. Taqman tiene la ventaja de que hibrida únicamente la secuencia ADN diana,
ya que es un oligonucleótido con fluorocromos en los dos extremos que hibrida en regiones internas y
específicas de los productos de PCR. La sonda Taqman y los cebadores se los diseñó basándose en la
secuencia del gen de granulina de un aislamiento nativo, y se utilizó la herramienta BLAST para
seleccionar​ ​secuencias​ ​que​ ​sean​ ​completamente​ ​homólogas.
Para elaborar los cebadores y la sonda Taqman de la región seleccionada, se usó la herramienta SciTools
Primer Quest, se escogió la opción con mejores características de temperatura de anillaje, estabilidad y
porcentaje​ ​de​ ​GC​ ​en​ ​los​ ​cebadores.
Para mejorar las condiciones de q-PCR se utilizó un sistema comercial con Taq Polimerasa, dinucleótidos
trifosfatos (dNTPs) y cloruro de magnesio (MgCl​2​) marca Promega. Se probaron varias condiciones de
amplificación, como gradientes de temperatura, distintos números de ciclos y concentraciones de
cebadores y sonda. Funciona utilizando el ADN viral que se obtiene a partir de suspensiones virales
purificadas y realizando la amplificación con las condiciones variables. La amplificación, la detección de
la​ ​señal​ ​y​ ​el​ ​análisis​ ​de​ ​datos​ ​se​ ​realizaron​ ​en​ ​el​ ​equipo​ ​ICyvler​ ​IQ​ ​(BioRad).
Referencia
Barrera, G., Murcia, J., Cerón, J., Cuartas, P., Guzmán, C., Villamizar, L. (2016) PCR EN TIEMPO
REAL: UNA METODOLOGÍA, ÚTIL PARA LA DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE
GRANULOVIRUS.​ ​Biotecnología​ ​18(2),​ ​24-31.kv