Enfoque multifactorial.

El diagnóstico del cáncer se basa tradicionalmente en la deteccion

de marcadores moleculares individuales (por ejemplo, mutaciones genéticas, niveles
elevados de PSA). Desafortunadamente, el cáncer es un estado de enfermedad en el cual
los marcadores individuales típicamente fracasaron para detectar o diferenciar muchas
formas de la enfermedad. Así, los ensayos que reconocen sólo un único marcador
demostraron ser de valor predictivo limitado. Un aspecto fundamental de esta invención
es que los diagnósticos de cáncer basados en la metilación y la detección, diagnóstico y
seguimiento terapéutico de este tipo de enfermedades proporcionarán mejoras
significativas sobre el estado de la técnica que utiliza análisis de un solo marcador
mediante el uso de una selección de múltiples marcadores. El enfoque analítico
multiplexado es particularmente bien adecuado para el diagnóstico del cáncer ya que el
cáncer no es una enfermedad simple, este enfoque de "panel" multifactorial es
consistente con la naturaleza heterogénea del cáncer, tanto citológicamente como
clínicamente.
La clave para la exitosa implementación de un enfoque de panel para las pruebas
diagnósticas basadas en la metilación es el diseño y desarrollo de paneles optimizados de
marcadores que pueden caracterizar y distinguir estados de enfermedad. La presente
invención describe una pluralidad de paneles de genes particularmente eficientes y
únicos, el análisis de metilación de uno o una combinación de los miembros del panel
permite la detección de trastornos proliferativos celulares de colon con una
particularmente alta sensibilidad, especificidad y/o valor predictivo. Desarrollo de las
pruebas médicas. Dos medidas de evaluación claves de cualquier detección médica o
prueba de diagnóstico son su sensibilidad y especificidad, que miden qué tan bien la
prueba se desarrolla para detectar con precisión todos los individuos afectados sin
excepción, y sin incluir falsamente a personas que no tienen la enfermedad objetivo (valor
predictivo).

El sistema fluorométrico consiste en una fuente de energía para excitar a los fluoróforos (a una
determinada longitud de onda de excitación) y un sistema de detección, que permita monitorear
la señal emitida (a una longitud de onda de emisión). La fuente de energía que proporciona la luz
de excitación para los fluoróforos puede provenir de una lámpara (tungsteno), una resistencia
(diodo emisor de luz) o un láser. Las diferentes longitudes de onda de emisión se detectan con
dispositivos que incluyen filtros, multiplicadores y fotodetectores.

Sistemas de detección usados en la PCR en tiempo real:

Los fluoróforos utilizados para seguir la amplificación del ADN durante la PCR en tiempo real
pueden ser de dos tipos: a) fluoróforos con afinidad por el ADN y b) sondas específicas para
fragmentos del ADN, es decir, que sólo emiten fluorescencia cuando se ha amplificado un
fragmento del ADN de interés (blanco).
Introducción:

En la actualidad, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real es la técnica más

sensible para la detección de ácidos nucleicos (ADN y ARN).

El análisis por (RT) PCR en tiempo real puede realizarse a partir de una amplia variedad de
muestras clínicas como tejidos frescos y fijados en parafina, LCR, sangre total, plasma, etc.
Detectando diferentes microorganismos a nivel cualitativo (presencia o ausencia) y cuantitativo
(carga viral). La velocidad de estas pruebas y el apoyo que dan al diagnóstico oportuno y certero le
otorgan un valor agregado.

se ha demostrado recientemente una asociación entre Fusobacterium nucleatum (Fn),

una bacteria anaerobia presente en la cavidad oral que puede causar periodontitis, y la
génesis y progresión del cáncer de colon. Es por esto que el PCR en tiempo real es un
buen método que nos puede ayudar no solo con el diagnostico y reconocimiento del
agente patógeno, sino que también el estudio futuro de sus mecanismos de resistencia.

Sistemas de detección usados en la PCR en tiempo real Los fluoróforos utilizados para seguir la
amplificación del ADN durante la PCR en tiempo real pueden ser de dos tipos: a) fluoróforos con
afinidad por el ADN y b) sondas específicas para fragmentos del ADN, es decir, que sólo emiten
fluorescencia cuando se ha amplificado un fragmento del ADN de interés (blanco).

Sonda: transferencia de energía entre dos fluoróforos: un donador (reportero) y un aceptor

(apagador o quencher), los cuales emiten fluorescencia a diferente longitud de onda. Cuando el
reportero y el apagador se encuentran próximos, el apagador absorbe toda la fluorescencia del
reportero. Cuando este par de moléculas se separa, la fluorescencia del reportero no puede ser
absorbida por el apagador y en consecuencia puede ser detectada por el fotodetector.

Protocolo

Este protocolo se utiliza para cuantificar el porcentaje de copias la bacteria FN a partir del ADN
genómico.

Equipo

• PCR en tiempo real

• Regulador de voltaje con no-break

• Computadora con el programa de análisis instalado (Hardware y un Software para la captura y el

análisis de los datos, respectivamente.)

- termociclador (debe ser capaz de mantener una temperatura uniforme para todas las
muestras y ser lo suficientemente rápido en la transición de temperaturas de una etapa a
otra (desnaturalización del ADN molde, alineamiento de los oligonucleótidos y síntesis).
- fluorómetro (unidad capaz de detectar señales fluorescentes)
para monitorear el progreso de la reacción de amplificación.
Materiales:

• Guantes de nitrilo libres de polvo

• Tubos o placas PCR de 200 µl de calidad óptica

• Puntas nuevas estériles de 10 y 100 µl

• Micropipetas de alta precisión de 20 µl y 200 µl

• Gradilla para tubos PCR

• Charola para hielo (conserva la mx antes de ser procesada)

Tubos ependorft de 2.5 ml.

Reactivos

• TaqMan Universal PCR Master Mix

• Agua grado biología molecular (ultrapura) y libre de nucleasas

• Sonda TaqMan®

• Sonda: p36s

herramienta para detectar la presencia de secuencias complementarias al ADN o ARN

diana u objetivo.

• Muestras del ADN: • ADN

*Fluoroforos cy3 y cy5. (la gracia de que sean fluoroforos distintos es que emiten fluorescencia a
distintas longitudes de onda

Destacando entonces que al ser una detección por sonda tendremos partidores específicos
además de una sonda asociada que detectará una región especifica del fragmento que yo quiero
amplificar

La taqman tiene 2 fluoroforos: uno emite fluorescencia y el otro es aceptor de esta fluorescencia
siempre que estén ambos flouroforos unidos al fragmento que quiero amplificar. Generalmente
son distintos el del gen normal y el mutante.

Antes de empezar Verificar que el fluoróforo para el ensayo sea el apropiado de acuerdo con el
equipo que se usará. El equipo debe estar calibrado, El equipo y el software deben estar
conectados a un no break para evitar que se interrumpa el ensayo o se pierdan datos por falla o
por cambios repentinos en el suministro eléctrico. Las superficies de trabajo deben estar limpias
para evitar la contaminación. Es muy importante trabajar con guantes sin polvo, limpiar las
superficies con papel sin pelusa y detergentes que degraden el ADN o bien con una solución de
hipoclorito de sodio al 10% para evitar cntaminacion, y asegurarse de haber recolectado todos los
materiales necesarios.
1) Preparar la mezcla en Eppendorf con el TaqMan Master Mix (enzima, dntps, Mg++, PCR
buffer) para la preparación de la muestra y controles. Que incluyen lo descrito en la
sección de reactivos (agua ultrapura), sondas para el gen mutado y gen normal (sondas de
hibridación).
Cuando la sonda hibrida con su secuencia blanco el fluoróforo es liberado por medio de la
actividad 5' exonucleasa de la DNA polimerasa, lo cual permite que su emisión sea
detectada por el termociclador
Este Taqman se unirá entonces al fragmento que quiero ientificar, con la ayuda de la
polimerasa se corta esta sonda y se liberara el fluoroforo.
2) Cargar la muestra de ADN en otra zona del laboratorio (no bajo las campanas esteril)
3) Procesar muestra
4) Controles internos con genes constitutivos para validar la corrida y muestra de ADN*
Realizar controles positivos (adna ya amplificado) y negativos dados por el kit (para
evaluar la calidad de nuestro desempeño y evaluar si nuestras muestras se encuentran
contaminadas. En este caso dados por el kit.
5) Resultados a través del sofware. Se observan las flouresencias de ambos genes (mutado y
normal) que va apareciendo a medida que se rompe la sonda. En el software del equipo
desplegar las curvas de amplificación en escala logarítmica
*cada vez que ocurra un ciclo va a dar un pick
La
La extracción de ADN de las bacterias se
La oobtencion de la mx se realizó después de 8-10 horas de su
incubación a 37°C en caldo Muller-Hilto. Luego se prosiguió con la
extracción de ADN a través de un kit comercial (solventes orgánicos).

Valor de Ct El Ct, del inglés cycle threshold, equivale al número de ciclos necesarios para que cada
curva alcance un umbral en la señal de fluorescencia

Resultados:
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcrtiempo.pdf

En la PCR-TR, los fluorocromos como el SYBR

Green o sondas marcadas, son adicionados
a la reacción de PCR para producir las señales
de fluorescencia (4,5). El SYBR Green
produce estas señales fluorescentes cuando
se une al ADN de doble cadena (ADNds

La eficiencia de una reacción de PCR-TR se

determina con una curva de calibración,
realizada con diluciones seriadas de una
concentración de ADN conocida y sus
valores de Ct
https://www.researchgate.net/publication/45266453_Determinacion_y_cuantificacion_de_bacter
ias_acidolacticas_por_PCR_en_tiempo_real